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摘 要：目的:分析能合成端粒dna重复序列的端粒酶在dmba诱导金黄地鼠颊囊癌变动态过程中的动态变化。方法:采用pcr基础上的端粒dna重复序列扩增法和elisa酶免疫技术,测定颊囊癌变组织端粒酶动态变化。结果:在诱癌过程中,颊囊粘膜组织端粒酶活性随组织病理学改变向恶性转化而增高,与自身对照相比较有显著差异,其升高在诱癌后期最明显。结论:端粒酶激活是肿瘤形成的早期分子标志,也是端粒长度稳定的主要因素。
近年来的研究发现,细胞的增殖与凋亡受染色体末端结构端粒长度控制,当端粒长度缩短到一定时,染色体稳定性降低,可能出现融合、重组甚至分解,导致细胞停止分裂增殖而进入凋亡。而端粒酶是一种能添加端粒dna重复序列至染色体末端的核糖核酸蛋白酶,它具有类似逆转录酶功能,可以自身rna为模板合成端粒dna重复序列,并转接到染色体3′末端,维持端粒长度［1,2］。研究表明,大多数正常组织和体细胞内端粒酶活性难测到(阳性率仅4%左右)。但端粒酶与恶性肿瘤发生有密切相关性。kim等［3］和counter等［4］研究报道，112种恶性肿瘤细胞株和肿瘤组织端粒酶活性阳性率高达85％以上。在正常细胞恶性转化中，细胞端粒长度明显缩短，而端粒酶激活使染色体端粒稳定地维持在一定长度，导致恶性转化细胞无限增殖，成为永生不死细胞（immortal cell）。目前对于端粒酶激活以及调控机理还认识不清。1994年kim等［3］首次报道了结合pcr技术测端粒酶活性的端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol，trap）,这使测定各种组织端粒酶活性成为可能。本研究首次应用pcr-trap法结合elisa分析法，半定量测定金黄地鼠颊囊癌变过程中的端粒酶动态改变，结合端粒长度变化，分析和了解端粒酶在癌变过程中的作用，并为进一步研究针对端粒酶的肿瘤基因治疗提供一定的实验依据。
1 材料和方法
1.1 主要试剂与设备
二甲基苯并蒽(dmba,sigma公司,美国),5′-（ccctaa)4-3′寡核苷酸探针(北京赛百盛公司),考马斯亮蓝染料(sigma公司),端粒酶pcr-elisa检测药盒（boehringer mannheinn公司),geneamp pcr 9600 thermal cycler(bio-rad公司),shz-22水浴恒温振荡器(江苏省太仓医疗器械厂),el312 microplate bio-kinetics reader(美国)。
1.2 金黄地鼠颊囊癌变动物模型建立
用dmba诱导，参见参考文献［5］。
1.3 金黄地鼠颊囊粘膜组织端粒长度测定
southern杂交法参见参考文献［5］。
1.4 金黄地鼠颊囊粘膜组织端粒酶活性检测
1.4.1 原理 考马斯亮蓝染色确定检测样本含端粒酶蛋白量，利用端粒酶具有逆转录功能，作用其底物（telomerase substrate，ts），合成端粒重复序列ttaggg，以此作为数目不等的模板，再经pcr循环扩增，放大端粒酶功能活性，用高灵敏度、非放射性的elisa方法检测pcr产物量，设定阳性和阴性对照,以od值作比较，判定端粒酶活性。
1.4.2 操作步骤 按端粒酶pcr-elisa检测药盒说明进行，检测样本端粒酶蛋白量确定为1 μg/μl，在el312e microplate读数仪上测定od值，以此判定端粒酶活性。
1.5 数据统计学处理
所测定的数据,采用t检验和方差分析进行各组差异分析,采用线性回归进行相关分析，检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 金黄地鼠颊囊癌变过程中端粒酶动态变化观察
金黄地鼠颊囊癌变过程中不同时期的端粒酶活性od值结果见表1。每次检测以药盒提供的阳性对照（胚胎肾细胞株hek293细胞）和煮沸法产生的阴性对照做elisa检测显色反应，其od值分别为：0.580±0.015和0.046±0.00352以此作端粒酶活性阴阳性标准，当样本od值除以阴性对照od值大于等于2时判定为阳性例，并以样本od值除以阳性对照od值计算相对端粒酶活性值，其结果见表2。
表1 地鼠颊囊癌变过程中不同时期的本新闻共3页,当前在第1页123
责任编辑：姚红祥
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