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摘要 目的:研究六亚甲基二乙酰胺(hmba)诱导人粘液表皮样癌(mec-1)细胞分化与细胞p53蛋白表达和细胞增殖周期的关系。方法:mtt比色法测定hmba对mec-1细胞体外生长的作用;feulgen染色测定细胞dna含量;abc免疫酶染色检测p53蛋白;fcm法测定细胞增殖周期。结果:hmba对mec-1细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性;hmba诱导的细胞与对照细胞比较,dna含量减少,p53蛋白水平降低,g1期细胞数增加和s期细胞数减少。结论:hmba对mec-1细胞的诱导分化作用与其调节p53基因蛋白表达和细胞增殖周期有关。
作者以往对低分化型粘液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma,mec)来源的mec-1细胞系的分化诱导研究表明,分化诱导剂六亚甲基二乙酰胺(hexamethylene bisacetamide,hmba)对体外培养的以及裸鼠体内移植的mec-1细胞均有显著的生长抑制作用和分化诱导作用［1,2］。目前,对hmba的分化诱导作用机理尚不十分清楚。本实验旨在探讨mec-1细胞的分化与p53抑癌基因蛋白表达和细胞周期的相互关系。
1 材料和方法
1.1 分化诱导剂配制及细胞培养
hmba(sigma,美国)配制成0.5 mol/l母液,用培养液稀释至所需浓度。人粘液表皮样癌mec-1细胞系(第四军医大学口腔生物学教研室建立)用含10%胎牛血清的rpmi 1640培养液(gibco,美国),在37 ℃、5% co2及100%湿度条件下培养。用mtt比色法［3］测定hmba以不同浓度、不同时间和不同方式对mec-1细胞体外生长的细胞存活分数的影响。
1.2 feulgen染色
mec-1细胞培养在含1 mmol/l的hmba培养液或对照培养液中,4天后,取细胞铺片,按常规feulgen染色法显示细胞核dna,用图像分析仪定量分析其相对含量,每个样本分析100个细胞,用t检验进行统计处理。
1.3 abc免疫酶染色
细胞处理及标本制备同1.2节。用鼠抗人突变型p53抑癌基因蛋白抗体(北京中山生物技术公司)及abc试剂盒(vector公司,美国),按常规abc法染色,标本分析同1.2节。
1.4 流式细胞术(fcm)
实验分3组,加药组mec-1细胞用1 mmol/l或4 mmol/l的hmba体外诱导培养48小时;去药组细胞用1 mmol/l或4 mmol/l的hmba体外诱导培养96小时,更换无药培养液培养48小时;对照组用无药培养液培养。分别用0.25%胰蛋白酶和0.02% edta(1∶1)消化细胞,制备单个细胞悬液,70%冷乙醇固定,pbs洗涤,再用1% triton x-100、0.01% rnase和0.05%pi处理,通过300目尼龙网备检。用profileⅱ型流式细胞仪,在488 nm激发波长下测定细胞dna,用multicycle软件分析细胞周期分布情况。
2 结 果
2.1 hmba对mec-1细胞生长的影响
用mtt比色法测定的结果见图1。hmba在1 mmol/l对mec-1细胞作用2天后开始产生抑制作用,并随着浓度增加和作用时间延长生长抑制作用更明显。在hmba作用4天后再去药培养,mec-1细胞逐渐恢复增殖。表明hmba对mec-1细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性,并具有一定的可逆性。
1 hmba对mec-1细胞生长的影响
hmba组 ○ 1mol/l,△ 2 mol/l,□ 4 mol/l
去除hmba组 ● 1 mol/l,▲ 2 mol/l,■ 4 mol/l
2.2 hmba对mec-1细胞dna含量及p53蛋白表达的影响
feulgen染色标本用图像分析仪分析结果显示,mec-1细胞在1 mmol/l的hmba诱导4天后,细胞核平均dna含量显著下降(表1)。
表1 hmba对mec-1细胞dna及p53
蛋白水平的影响
分组
dna()
p53()
p53阳性率(%)
对照组
183.42±6.73
183.70±8.60
16.31
hmba组
175.54±3.91
175.72±6.00
9.71
p＜0.05
p53抗体染色标本用图像分析仪分析结果显示,mec-1细胞在1 mmol/l的hmba诱导4天后,细胞抑癌基因p53蛋白水平显著下降(表1)。
2.3 hmba对mec-1细胞系细胞增殖周期的影响
hmba诱导48小时后,处于s期的mec-1细胞比例下降、g1期比例升高,并呈剂量依赖性。hmba诱导96小时后去药培养48小时,mec-1细胞各时相比例有所恢复(表2)。本新闻共2页,当前在第1页12
责任编辑：姚红祥
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