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　brdu体内标记腺样囊性癌肺转移灶      

发表时间：2007-1-9 9:40:00

更多保健方面的文章请到中国保健网>>      关键词：溴脱氧尿嘧啶核苷；肺转移癌模型；细胞株acc-m；体内标记 　　摘　要：目的　动态观察非放射性标记物brdu在动物体内标记情况，为brdu取代3h-tdr提供依据。方法　6只裸鼠经尾静脉分别注入acc-m细胞1×106/0.2ml,4周后腹腔注射brdu 200μg/g体重，注射0.5h～20h期间分别取材固定，免疫组化abc法染色，统计标记指数。结果　所有裸鼠形成肺转移癌阳性细胞核标记指数(li)约20%～40%。单次注射brdu后，li不随注射时间延长而增加。正常组织中，肝窦和肠绒膜上皮有标记阳性细胞，肾、胰、脾等器官未见。结论　brdu体内标记法可替代3h-tdr应用于细胞增殖研究，避免放射性污染，但在人体内标记，尚需进一步探索。 　　氚胸腺嘧啶核苷(3h-tdr)标记用于细胞增殖及分子遗传研究等早已成为常规，但有放射性污染、检测复杂、费时等缺点。因此，许多学者致力于研究非放射性标记物的开发和应用。溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,brdu)是dna前体胸腺嘧啶核苷的类似物，可与内源性胸腺嘧啶核苷竞争掺入s期细胞dna，其掺入机制、掺入敏感性及可靠性均与3h-tdr相似，是80年代中期以来最受重视的非放射性标记物之一。由于brdu属小分子半抗原，且价格昂贵，国内研究明显滞后，近年才见个别报道。本文在brdu抗原制备和抗体制备等前期工作的基础上，用brdu对本室克隆筛选的高转移性腺样囊性癌细胞(acc-m)［1］产生的裸鼠肺转移癌模型进行动物体内标记，初步观察brdu在体内标记的效果，为深入研究并最终取代3h-tdr奠定基础。 　　1　材料与方法 　　1.1　主要试剂和动物 　　brdu多克隆抗体(pcab)，工作效价1∶6.4×105，上海第九人民医院口外实验室制备；羊抗兔igg，上海市医学检验重点实验室；正常羊血清，vector公司；abc kit,vector公司；brdu,mw307.12d，sigma公司；acc-m，上海第九人民医院口外实验室克隆；balb/c裸鼠，中科院上海实验动物中心。 　　1.2　肿瘤模型的制备 　　取6周雌性balb/c裸鼠6只，无菌饲养，经鼠尾静脉分别注射acc-m细胞1×106/0.2ml，诱发肺转移癌。4周后，于每只鼠腹腔注射pbs溶解的brdu 200μg/g体重，分别于注入brdu 后0.5、1、2、4、16和20h各处死1只，解剖肺、肠、肝、胰、脾和肾等器官，70%酒精固定＞24h，常规石蜡包埋、切片。 　　1.3　brdu标记免疫组化染色 　　5μm连续切片于50°c烤箱热烘30min，脱蜡至水；0.3%过氧化氢甲醇，室温30min;0.05mol/l ph7.6 tris-hcl缓冲液洗涤5min×3;2mol/l hcl 37°c,30min;1mol/l naoh室温2min;0.05%胰蛋白酶，室温30min;10%羊血清，室温30min;brdu pcab(1∶200),4°c过夜；阳性对照为brdu抗体(1∶50),vector公司；阴性对照为tris-hcl缓冲液；自然复温20min后，羊抗兔igg(1∶200)30min;abc(1∶100)室温1h;dab镜下显色，苏木素复染，封片。主要步骤之间均以tris-hcl缓冲液洗涤。 　　1.4　观察方法 　　每张切片随机观察1000个细胞，计数阳性细胞核标记指数(li)。 　　2　结果 　　接种acc-m细胞4周后，6只裸鼠全部形成肺转移癌。鼠肺体积均有增大，表面簇状密布灰白色小结节，质韧实。光镜下brdu阳性标记为胞核黄褐色，肺转移癌组织的li约20%～30%。转移癌的癌巢中阳性细胞li高达40%左右，有丝分裂像多见，见图1。 　　注射brdu后不同时间的癌组织li无明显差别，即使注入20h时，其肺转移癌的li也未见增多。其它组织如肝脏的血窦周围和肠绒毛上皮细胞也可见阳性标记细胞，见图2、图3。而在肾、胰、脾等脏器的各不同时间的取材标本，均未见到阳性细胞。 　　3　讨论 　　acc-m细胞形成裸鼠肺转移癌的结果确切稳定，而且brdu体内掺入的li高达40%，说明acc-m细胞增殖非常活跃，所形成肿瘤的生长潜力大，恶性程度度。brdu选择标记s期细胞，并随标记细胞增殖传代，使子代细胞显色。本组标本brdu标记后于不同时间取材固定，但brdu掺入标记结果无明显变化，并非随brdu注入动物体内的时间延长，而li增多。brdu的掺入半衰期不足3h［2］，而acc-m细胞的增殖周期为38h［1］。本文采用一次性脉冲标记方法，未连续追加，因此，即使20h时观察的li也未见有明显增加，可能因acc-m细胞倍增时间长，brdu半衰期短两方面因素所致。有人用可生物降解的缓释胶囊装载brdu注入体内或在体内组织中埋植brdu渗透性微型泵等方法［2～4］，以控制brdu释放血流中的剂量和节奏，从而使brdu标记目标可动态观察。这种方法对增殖周期较长，增殖缓慢的组织细胞能收到较好效果，如神经组织的生长等。本新闻共2页,当前在第1页12 责任编辑：姚红祥

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