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作者单位：高志（第四军医大学博士后流动站）；毛祖彝（华西医科大学口腔医学院 610041）；何永文（华西医科大学口腔医学院 610041）；徐平平（华西医科大学口腔医学院 610041）
关键词：癌变；端粒长度；颊囊
摘 要：目的:探讨dmba诱导金黄地鼠颊囊癌变过程中端粒长度动态变化。方法:应用southern杂交技术分析金黄地鼠颊囊癌变组织端粒dna序列长度。结果:金黄地鼠颊囊癌变过程中,癌变侧颊囊粘膜组织端粒长度较自身正常对照侧明显缩短,尤以诱癌后期缩短速率最快。结论:端粒长度缩短在癌变早期显著。
随着现代分子生物学、遗传学对癌变机理的研究发展,人们认识到癌变过程是正常细胞转变成无限增殖、逃避凋亡的癌细胞的过程。国外研究显示［1］,细胞的寿命是受染色体末端结构——端粒(telomere)dna序列长度控制。端粒长度的缩短可影响染色体稳定性,染色体可能发生融合、重组和被末端降解酶类作用,从而导致染色体分解,细胞进入凋亡。有研究表明［2，3］正常细胞与癌细胞的端粒长度有差别,人们在一些瘤株和永生化细胞系以及癌肿组织中发现其端粒长度比正常组织细胞明显缩短。目前国内外对口腔癌变过程中端粒的行为的研究较少,对动态观察的报道则更少见。本实验研究,通过应用化学诱癌剂诱发金黄地鼠颊囊产生癌变,建立实验性口腔癌变模型,采用现代分子生物学技术观察测定端粒长度在诱发癌变动态过程中的变化,以期了解端粒在癌变过程中的作用,初步探讨口腔癌变的分子机理。
1 材料和方法
1.1 主要试剂与设备
二甲基苯并蒽(dmba,sigma公司),denhardt液(自配),5′-(cctaa)4-3′寡核苷酸探针(北京赛百盛公司),5′-末端dna标记药盒(boehringer manmheim公司),model 785 vacuum blotter(bio-rad公司),多功能反应杂交仪(协海医疗仪器公司),gel doc-1000型凝胶成像系统(bio-rad公司)。
1.2 动物模型建立及分组
金黄地鼠颊囊癌变动物模型的建立参见参考文献［5］。选用8周龄叙利亚金黄地鼠52只,随机分为5组,第1组4只,不加任何处理措施,饲养3 d处死。其余4组为涂药组,各12只,用0.5%dmba丙酮溶液涂布于地鼠右侧颊囊粘膜,颊囊左侧涂丙酮液作自身对照。每周涂药2次,至第12周。分别在涂药后第7、10、14、20周末肉眼观察和记录,然后断颈处死地鼠,取颊囊组织块分别做he染色组织切片进行光镜观察,并做端粒长度检测。
1.3 southern杂交测定染色体末端dna重复片段长度
1.3.1 原理 利用限制性内切酶作用组织dna,得到染色体末端dna重复片段5′-ttaggg-3′线性结构(terminal restriction fragment,trf),以碱基配对原理,用同位素标记的5′-(ccctaa)4-3′寡核苷酸探针与之杂交,测定杂交带峰值处dna长度,即为trf长度均值,以此表示端粒长度。
1.3.2 southern杂交 酚-氯仿抽提法制备地鼠颊囊粘膜组织dna,用hinfⅰ单酶消化dna,消化的dna用1%琼脂糖凝胶电泳,分子量标准采用hind ⅲ酶切加入dna和48 高分子量dna标准,紫外光投射仪上准确记录dna分子量标准的各带所距加样孔距离,作为杂交后测算杂交带峰值dna长度参照距离。电泳后凝胶置于model 785真空转膜装置上,把dna转移至尼龙膜上,用同位素γ-32p标记的5′-(ccctaa)4-3′寡核苷酸探针与膜杂交,杂交膜置x线片暗盒内,-20℃放射自显影48 h。
1.3.3 x线片扫描分析 常规x线片显影、定影。采用gel doc-1000型凝胶成像系统扫描分析x线片,确定杂交带峰值位置,并测定峰值距膜顶边距离,对照分子量标准求得trf长度均值。
1.4 数据统计学处理
所测定的端粒长度数据,采用t检验分析各组差异,采用线性回归进行相关分析,检验水准为α=0.05。
2 结 果
2.1 金黄地鼠颊囊癌变组织学观察
经大体和光镜下观察,地鼠颊囊涂dmba侧粘膜癌变过程中各组地鼠颊囊粘膜的病理改变结果见表1,自身对照组各期颊囊粘膜无变化,光镜下检查与正常颊囊粘膜表现一致。
表1 各组金黄地鼠涂dmba侧颊囊粘膜
病理改变结果(单位:只)
病理类型
7周组
10周组
14周组
20周组
单纯性上皮增生
4
非典型性上皮增生
8
7
原位癌
5
5
鳞状细胞癌早期
4
鳞状细胞癌晚期
7
合 计
12
12
9(死3)
7(死5) 2.2 成年金黄地鼠颊囊粘膜组织不同年龄期的端粒长度改变
金黄地鼠颊囊癌粘膜组织端粒长度测定的southern杂交同位素自显影图见图1。以地鼠实际周龄进行分组,把初始和诱癌各阶段的对照侧颊囊正常粘膜组织端粒长度结果总结于表2中,其成年金黄地鼠颊囊粘膜组织端粒长度随年龄期增大,而逐渐缩短(r=-0.9887)。平均每周缩短长度大约为0.17 kb。
表2 地鼠不同年龄期正常颊囊粘膜组织
端粒长度测定结果(±s,kb)
实际周龄(周)
例数
trf平均长度
8
3
15.90±3.52
15
12
15.30±2.12
18
12
14.90±1.97
22
9
13.80±2.23
28
7
12.50±2.55
图1 dmba诱发金黄地鼠颊囊癌粘膜组织端粒
长度测定的southern杂交同位素自显影图
注:t 颊囊癌组,n 正常组;1～8为第14周,9～14为第20周
2.3 金黄地鼠颊囊癌各组端粒长度的变化
实验结果显示,每组涂药侧与自身对照侧比较,其涂药侧端粒长度明显缩短于对照侧,差异有统计学意义(p＜0.05)。计算两侧每周平均端粒缩短长度,涂药侧为0.225 kb,对照侧为0.17 kb,说明涂药侧在诱癌过程中端粒dna重复片段丢失比自身对照侧要快。
表3 金黄地鼠颊囊癌各组粘膜组织
端粒长度结果(±s,kb)
组别
例数
trf平均长度
涂药侧
自身对照侧
第7周
12
13.20±1.93
15.30±2.12
第10周
12
12.30±1.75
14.90±1.97
第14周
9
8.30±2.73
13.80±2.23
第20周
7
10.70±2.34
12.50±2.55 2.4 金黄地鼠颊囊癌变组织端粒长度缩短速率的动态观察
计算端粒长度缩短速率结果见表4。由表4可见,诱癌过程中第14周端粒长度缩短速率最大,第10周时次之,而第20周相对速率较小,说明端粒长度dna序列丢失在诱癌后期(第14周)最明显。
表4 各组金黄地鼠颊囊癌变组织端粒长度
缩短速率结果
组别
端粒长度缩短速率
第7周
0.1372
第10周
0.1745
第14周
0.3985
第20周
0.1445 3 讨 论本新闻共2页,当前在第1页12
责任编辑：唐建华
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