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突变受体阻断nih3t3细胞中rhbmp-
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发表时间:2007-1-9 9:40:00
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在脊椎动物中胚层的发育诱导过程中,骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, bmp)是重要的背-腹化发育促进因子。bmps在细胞表面与bmp的ⅰ、ⅱ型受体相互作用。为研究bmps信号转导在组织发育和细胞分化中的作用,我们以bmps ⅱ型突变受体的cdna为目的基因,以nih3t3细胞为载体细胞,构建了稳定表达bmps ⅱ型突变受体的细胞株。从而为从信号转导水平探讨bmps对细胞分化及组织器官发育的调控作用奠定了基础。
一、材料和方法
1.材料:pc-4真核表达载体(含bmps ⅱ型突变受体cdna); fugene6 transfection reagent kit购自boehringer mannheim; rhbmp-2由军事医学科学院基础医学研究所生化实验室提供。
2.方法:①稳定表达bmps ⅱ型突变受体的细胞的构建:用fugene6 transfection reagent kit真核转染试剂盒将pc-4真核表达载体转染nih3t3细胞,用g-418和neo基因探针筛选出细胞克隆。②在培养板上接种两组转染细
胞,一组在含10%胎牛血清的dmem、标准环境中培养,另一组在培养液中加入rhbmp-2 50 μg/l。利用细胞生长曲线、mtt检测、流式细胞仪检测、brdu检测等观察细胞的增殖和dna合成;利用alp检测试剂盒及oc检测试剂盒观察细胞是否有成骨趋向。设未转染细胞及空白对照。对结果进行统计学分析。
二、结果
1.加入rhbmp-2 50 μg/l后,未转染细胞体积变小,由梭形向多角形转化;而转染细胞未见明显变化。
2.细胞生长曲线、mtt检测、fcm分析、brdu检测显示:加入rhbmp-2 50 μg/l后,未转染细胞dna合成变慢,细胞增殖力下降,与加药前差异有显著性;而转染细胞加药前后差异无显著性。
3.alp检测及oc检测结果显示,加入rhbmp-2 50 μg/l后,未转染细胞的alp活性增高,oc值比加药前变高;而转染细胞加药前后差异无显著性。
三、讨论
bmps是tgf-β超家族成员,其在胚胎发育、器官形成中的重要作用日益为人们所认识。tgf-β超家族的成员都结合两种特异受体发挥作用,分别叫做ⅰ型及ⅱ型受体。这些受体都有保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。bmps在细胞表面与ⅰ、ⅱ型受体相互作用。受体与配体结合的特异性主要取决于ⅱ型而非ⅰ型受体。
bmps活性二聚体与受体复合体结合,导致ⅰ型受体的磷酸化,ⅰ型受体再作用于smad 1或smad 5。smad 1或smad 5被激活后再结合smad 4,该复合物进入胞核后,再作用于下游因子,影响一些特定基因的转录,参与细胞内生理活动。促使ⅰ型受体的磷酸化是信号传导所必需的。ⅱ型受体激酶结构域突变导致受体复合物中的ⅰ型受体未被磷酸化,那么bmp的信号不能被传导。
为研究bmps信号转导在组织发育和细胞分化中的作用,我们构建了bmps ⅱ型突变受体的真核表达载体,命名为pc-4。用真核转染方法建立了稳定表达bmps ⅱ型突变受体的细胞株。结果显示,转染细胞加入rhbmp-2后,其形态、活力、alp活性及oc含量都有显著性变化,而未转染细胞在加入rhbmp-2后差异无显著性。这说明rhbmp-2的信号转导被bmps ⅱ型突变受体阻断了。
pc-4真核细胞表达载体可用于研究bmps信号对间充质细胞分化的调控,对于研究和阐明bmps信号转导在组织发育和细胞分化中的作用具有重要意义。
责任编辑:韩晓炜
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