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摘要 目的:本研究通过检测胎鼠及出生后早期颞颌关节发育中的细胞凋亡与bcl-2基因表达的变化,探讨细胞凋亡与bcl-2基因在颞颌关节发育中的作用。方法:利用原位末端标记法(tunel)及原位杂交检测mrna技术,对胚胎及生后1周sd大鼠颞颌关节发育不同时期细胞凋亡及bcl-2基因的表达情况进行观察。结果:各时期髁状突软骨细胞中均有凋亡细胞出现,凋亡细胞主要分布于软骨增殖带及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域;关节腔开始形成时髁状突软骨表面细胞凋亡明显,出生后凋亡细胞于关节的功能部位(髁状突前斜面)更明显。bcl-2原位杂交:出生前、后的髁状突软骨增殖层及浅肥厚层大部分细胞bcl-2表达阳性,而进入深层肥厚层仅有极少数bcl-2阳性表达的成熟软骨细胞散在分布。结论:由bcl-2基因调控的细胞凋亡在颞颌关节发育中起着重要的调控作用。
1> 近来,由颞颌关节(tmj)的发育异常造成的左右关节不对称、关节发育不良及发育期的正畸治疗引起的颞颌关节功能紊乱症(tmd)逐渐受到重视。tmj发育的研究表明下颌骨髁状突是下颌骨的主要生长区,在颞颌关节发育的早期,下颌骨髁状突主要由软骨细胞组成,此期的下颌骨髁状突的软骨层具有类似于长骨生长板独立生长的特性,而且髁状突软骨的生长主要是受内在基因的控制［1］。有关颞颌关节发育中的细胞凋亡及其调控基因bcl-2的研究尚未见报道。本研究通过观察颞颌关节发育中的细胞凋亡(apoptosis)及bcl-2基因的表达,以探讨颞颌关节发育中细胞凋亡与bcl-2基因的内在调控作用。
1 材料和方法
1.1 动物模型及标本制备
选用纯系3月龄sd大鼠(上海产)20只,按雌雄4∶1的比例同笼,每天早晨8:00观察雌鼠阴栓,以观察到阴栓计为妊娠0 d,分别于妊娠(e)13、14、15、16、17、18、19、20 d脱颈处死大鼠,切取胎鼠颞颌关节部置于4%的多聚甲醛中固定,另取出生后(p)1、2、3、4、5、6、7 d幼鼠颞颌关节部(沿正中线切开鼠头后分切)置入含盐酸、甲酸及冰醋酸的4%多聚甲醛液中充分固定、脱钙,流水冲洗后,常规脱水、石蜡包埋。作tmj矢状切片,厚度约5 μm,分别用于he、tunel染色及原位杂交。切片前载玻片预先严格清洁处理并涂apes胶。
1.2 原位末端标记法(tunel法)标记凋亡细胞
tunel法(oncor公司,美国):切片常规脱蜡至水,室温下20μg/ml的蛋白酶k消化15 min;3%h2o2的pbs溶液中处理5 min后,加50μl的平衡液(tunel试剂盒原配)1 min;再加含tdt酶反应液15μl,37℃反应1.5 h后用预热的中止反应液中止反应(tunel试剂盒原配);缓冲液1漂洗2次(15 min/次)后加2%的正常羊血清孵育30 min;滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体置于湿盒中孵育2 h;经缓冲液1、缓冲液3漂洗后,加新配制的显色液(nbt/bcip显色系统用缓冲液3配制,nbt4.5μl、bcip 3.5μl、左旋咪唑0.24 mg/ml)20μl,暗处显色。中止显色后,梯度酒精脱水,二甲苯透明封片。
1.3 原位杂交检测bcl-2 mrna表达
1.3.1 探针及标记 质粒pdor-sb 8.4(由第四军医大学生化教研室朱峰博士惠赠)含1.9 kb的bcl-2基因片段。取已鉴定的质粒dna,经ecori酶切后,将目的基因用冻溶法回收。bcl-2探针参照地高辛标记检测试剂盒(boehringer mannheim公司)说明书,采用随机引物法标记。
1.3.2 bcl-2原位杂交 石蜡切片脱蜡至depc水,分别用0.1 mol/l hcl和20μg/ml的蛋白酶k处理,梯度酒精脱水后室温干燥;用地高辛标记探针于42℃杂交后,分别用2×ssc、1×ssc、0.5×ssc、缓冲液1、缓冲液2依次充分洗涤;2%正常羊血清封闭30 min后,滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体反应2 h;经缓冲液1、缓冲液3漂洗后,加新配制的显色液(nbt/bcip显色系统)20μl,暗处显色。中止显色后,梯度酒精脱水,二甲苯透明封片。
2 结 果
2.1 he染色
e13 d tmj区开始出现未分化间充质细胞聚集、增殖、分化为软骨细胞,至e14 d tmj髁状突软骨组织增厚,软骨各层分界明显;e14～e15 d关节腔开始形成,e17～e18 d关节盘出现;e13 d即可见下颌骨体部端有骨化出现,以后骨化逐渐扩展到髁状突颈部;出生后关节软骨逐渐变薄,下颌骨骨化接近关节软骨区。本新闻共3页,当前在第1页123
责任编辑：姚红祥
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