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摘要 目的:检测单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)基因的转导对高转移性涎腺腺样囊性癌细胞(acc-m)生物学行为的影响。方法:对基因转导细胞作生长曲线测定、电镜观察、细胞周期检测、细胞表面组织相容复合物(mhc)ⅰ类和ⅱ类分子表达变化的测定。结果:hsv-tk基因转导组和亲本肿瘤细胞组无明显差别。结论:hsv-tk基因的转导对acc-m细胞的生物学行为无明显影响。
尽管绝大多数报道认为基因转导(主要是细胞因子基因)对肿瘤细胞的生物学特性无明显影响,但由于对肿瘤细胞转导单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,hsv-tk)基因后的生物学特性研究极少,本文从各方面对转导hsv-tk基因后的高转移性涎腺腺样囊性癌细胞株(acc-m)细胞的生物学特性作了研究。
1 材料和方法
1.1 生长曲线的测定
将acc-m、转导空白载体的acc-m细胞(amln)及转导hsv-tk基因的acc-m细胞(amtk)组细胞常规培养,每组取对数生长期细胞1×105接种于96孔板中,每2 d计数1次孔中细胞总数,每组细胞每次计数3个孔。
1.2 扫描电镜观察
将细胞培养于直经1.5 cm的玻片上,用pbs将细胞冲洗干净后,2%戊二醛固定48 h,常规制片。
1.3 透射电镜观察
将2×106的培养细胞,用pbs洗2次,2%戊二醛固定48 h。用刷子将细胞刮下离心,常规包埋、切片。
1.4 流式细胞术检测基因转导细胞dna含量变化
流式细胞术(flow cytometry,fcm)观察基因转导细胞dna含量的变化［1］。各组取2×106的培养细胞用pbs洗2次,胰酶消化,pbs洗后,加2.5 ml预冷的pbs充分悬浮细胞,再慢慢滴加等量的冷无水乙醇,4℃保存24 h以上,离心(1500 r/min,5 min)去上清,以pbs洗2次,并调细胞密度至1×106～1×107/ml,加70 μl细胞悬液至一fcm专用管,并加1%rnase100 μl,37℃30 min,加70 μl碘化丙啶(propidium iodide,pi)染料(终浓度为25～50 μg/ml),尼龙膜过滤,室温置10 min后上机检测。
1.5 流式细胞术检测细胞表面主要组织相容复合物分子表达
fcm观察细胞表面主要组织相容复合物(major histocompatibility complex,mhc)ⅰ、ⅱ类分子表达的变化［2］。2×106细胞,胰酶消化后pbs洗2次,去上清后加入100 μl鼠抗人mhcⅰ类或ⅱ类ⅰ抗(由上海市免疫学研究所提供),冰浴30 min(每5 min摇匀1次),再用大量pbs洗2次,离心(1500 r/min,5 min),去上清加入荧光素异硫氰酸盐(fluoroscein isothiocyanate,fitc)标记的绵羊抗鼠iggⅱ抗(购自华美生物工程公司)100 μl,冰浴30 min,每5 min摇匀1次,再用大量pbs洗2次,加300 μl pbs后上机。
2 结 果
2.1 生长曲线
acc-m、amln、amtk细胞体外培养时,未见明显的生长行为改变,生长曲线测定也证明了这一点(图1)。
图1 acc-m、amln和amtk细胞体外培养生长曲线
2.2 各细胞周期dna含量的变化
fcm检测细胞周期dna变化,结果显示,acc-m细胞转导入plxsn空白载体和hsv-tk基因载体pl(tk)sn后,细胞周期也未发生明显变化。
2.3 细胞表面mhc分子表达的检测
通过fcm检测各种细胞表面mhcⅰ、ⅱ类分子的表达,结果显示细胞转导入plxsn空白载体,细胞表面的mhcⅰ、ⅱ类分子的表达无明显变化;而转导hsv-tk基因之后,mhcⅰ类分子表达由原先的4.12%上升到16.23%,而ⅱ类分子由3.90%上升到8.40%。amtk细胞加用40 μmol/l无环鸟苷(ganciclovir,gcv)24 h后,细胞表面的mhcⅰ、ⅱ类表达与未用gcv时无明显差别。但40 μmol/l gcv作用4 d之后,细胞表面的mhcⅰ类分子表达由原先的5.64%上升到31.85%,提高了5.65倍;而mhcⅱ类分子的表达则由10.20%上升到91.33%,提高了8.95倍(图2)。
图2 amtk细胞经gcv处理后细胞表面mhcⅰ类及ⅱ类分子表达变化
a 经gcv处理24 h细胞表面mhcⅰ类分子表达(5.24%)本新闻共2页,当前在第1页12
责任编辑：姚红祥
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