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　维甲酸受体-β基因联合维甲酸对t      

发表时间：2007-1-9 9:40:00

更多保健方面的文章请到中国保健网>>      　　摘　要：目的　研究已证实维甲酸受体-β(retinoic acid receptor-beta，rarβ)对某些类型的恶性肿瘤细胞有诱导分化和凋亡作用。现观察转导rarβ基因联合全反式维甲酸(all trans retinoic acid，atra)对tca8113细胞的凋亡作用。方法　先应用脂质体将rarβ基因导入tca8113细胞中，然后采用活细胞计数、透射电镜、流式细胞仪等方法观察atra对转基因细胞的凋亡影响和生长抑制作用。结果　转rarβ基因tca8113细胞在1μmol/l atra作用10天后，细胞生长抑制率达90.2%；光镜和透射电镜下观察都可见到典型形态变化的凋亡细胞；fcm测定结果表明，细胞凋亡率高达80.7%。而母本细胞tca8113凋亡率小于20%。结论　rarβ基因可能是atra诱导tca8113细胞产生显著凋亡作用的“靶分子”。rarβ基因联合维甲酸治疗某些口腔鳞癌将是有效和可行的。 　　我们以往的研究结果表明，tca8113细胞中维甲酸受体-β(rarβ)基因转录水平很低，全反式维甲酸(atra)联合干扰素(interferon-gamma，ifnγ)对其有明显的上调作用，且该作用与细胞凋亡密切相关。提示rarβ基因转录表达上调是纠正tca8113细胞分化、凋亡障碍的主要途径。将rarβ表达质粒导入tca8113细胞中，使其功能性表达，然后观察细胞增殖、凋亡等生物学特性变化，将有助于了解rarβ基因在凋亡诱导过程中所发挥作用。 　　1　材料与方法 　　1.1　rarβ质粒扩增、鉴定 　　本实验所用psg5rarβ表达质粒由dr.pierre chambon(inserm，strasbourg，france)惠赠。psg5 rarβ载体为4kb,rarβ cdna片段为1.4kb,限制内切酶识别位点为ecori、bamh-i［1］。lipofectamine reagent(gibco brl)，柱离心式质粒少量抽提试剂盒(上海华顺生物试剂公司)，内切酶ecori、bamh-i(华美公司)。 　　1.1.1　质粒转化(transformation)［2］ 　　(1) 取ecoli dh5α 0.1mol/l cacl2感受态细菌冰浴5min，轻摇试管。 　　(2) 每管接种50μl细菌，并加入10ng rarβ质粒。轻晃试管，混匀，冰浴20min。 　　(3) 42°c水浴细菌50s后立即冰浴2min。 　　(4) 每管加入950μl lb培养基，置摇床37°c孵育5h。 　　(5) 取100μl转化液接种含氨苄青抗生素的琼脂平板，孵育过夜(24h)37°c。 　　1.1.2　质粒抽提步骤［2］ 　　按柱离心式质粒抽提试剂盒说明书进行，具体步骤简述如下： 　　(1) 将细菌沉淀重悬于150μl bl buffer中(含终浓度100μg/ml rnase a)，剧烈振荡。 　　(2) 在5min内加入150μl缓冲液温和颠倒离心管5次，再加210μl b3 buffer立即颠到5次。 　　(3) 离心10min(12000r/min)将吸附柱放入一个干净的2.0ml离心管中，将上清液移入吸附柱中，静置1min后离心30s，弃液体。 　　(4) 将450μl w1 buffer加入吸附柱中，静置1min，离心3s，弃液体，再离心1min，去除残留液。 　　(5) 将吸附柱放入1.5ml离心管中，50μl洗脱缓冲液加入吸附柱，静置1min，离心1min，存贮于-20°c，备用。 　　1.1.3　酶切鉴定 　　取质粒dna 2μg　　2μl 　　co-buffer　　2μl 　　bamh-i　　1μl 　　ecori　　1μl 　　双蒸去离子水　　14μl 　　总体积　　20μl 　　稍混匀后，在37°c水浴1h。 　　2%琼脂糖凝胶电泳酶解产物。 　　1.2　细胞rarβ基因转染和筛选［3］ 　　1.2.1　tca8113细胞准备　tca8113细胞从液氮冰存中复苏，培养于rpmi 1640培养液中(含15%灭活小牛血清，青霉素、链霉素分别为200u/ml)。37°c，5%co2饱和空气和湿度培养箱中培养。转染前24h，胰酶消化指数生长期细胞，按2×105/孔接种于6孔培养板，细胞约70%融合时进行转染。 　　1.2.2　dna-脂质体复合物制备　rarβ表达质粒2μg，选择性标志质粒psv2-neo 2μg，脂质体lipofectamine 24μl用无血清prmi1640培养液稀释至200μl，充分混匀后，室温下放置30min，使其形成脂质体-dna复合物，无血清培养液稀释至1ml待用。本新闻共3页,当前在第1页123 责任编辑：姚红祥

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