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　大鼠舌癌变细胞分化异常的表型特征——角蛋白谱分析--中国口腔网      

发表时间：2007-1-9 9:40:00

更多保健方面的文章请到中国保健网>>      　　摘　要：目的　阐明口腔癌变细胞分化异常的表型特征。方法　lsab免疫组化方法检测69例4-硝基喹啉-1-氧化物(4nqo)口服诱发大鼠舌癌变各期组织分化标志角蛋白(ck)10，13，14的表达。结果　随口腔癌变进展，ck14自基底层向上逐渐延伸至基底上层表达；基底上层ck13表达逐渐减少；基底上层ck10表达在癌前逐渐上升，成癌后则聚然下降。结论　口腔癌变是一种细胞分化异常疾病，该过程中角蛋白谱的变化是上皮细胞分化异常的主要表现。 　　现代肿瘤发育生物学观点认为，肿瘤起源于机体处于增殖状态的正常干细胞，它的发生主要表现为一种分化障碍和异常，不是去分化(dediffertiation)现象，而是由于基因表达的程序发生差错所导致的分化异常，即异分化(disdifferentiation)［1］sup>。口腔癌发生是一个多阶段过程，从组织形态学看，一般表现为单纯性增生→异常增生→原位癌→侵袭性癌这样一个自然病程。我们在建立4-硝基喹啉-1-氧化物(4nqo)饮水诱发大鼠舌癌变模型的基础上，运用lsab免疫组织化学技术对鳞状细胞分化标志物——角蛋白(cytokeratin,ck)在大鼠舌癌变过程中的表达变化进行了观察，以阐明口腔癌变细胞增殖与分化异常的表型特征。 　　1　材料与方法 　　1.1　标本来源 　　69例0.002% 4nqo饮水(0～32周)诱发sd大鼠舌癌变组织存档蜡块，所有标本均经双盲法病理证实。正常8例；单纯性增生8例；轻中度异常增生8例；重度异常增生18例；原位癌11例；鳞癌16例。 　　1.2　试剂 　　(1)一抗(表1) 　　(2) lsab试剂盒(dako) 表1　一抗的名称、来源、工作浓度及其特异性 抗体* 克隆 来源 工作浓度 特异性 鼠抗人ck10单抗 de-k10 dako 1∶15 角化标志 鼠抗人ck13单抗 ks-1a3 sigma 1∶100 复层标志 鼠抗人ck14单抗 ckb1 sigma 1∶200 基底层标志 　　*：不同种属间ck存在交叉免疫反应1.3　微波抗原修复lsab免疫组化染色 　　在经2% apes/丙酮处理过的载玻片上作4μm连续切片5张。其中，1张作he染色；1张用pbs替代一抗作阴性对照；另3张分别作上述抗体的免疫组化染色。切片38°c烘干过夜，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。3% h2o2-甲醇阻断内源性过氧化物酶30min，切片浸没在0.01mol/l ph 6.0柠檬酸钠缓冲液中，700w微波炉中高功率5min修复抗原。1∶20正常免血清封闭30min。分别滴加上述一抗，4°c孵育过夜，次日pbs漂洗5min×3次。加1∶200兔抗鼠免疫球蛋白，室温下40min，pbs漂洗5min×3次。加1∶200抗生蛋白链菌素(sa)，室温下30min，pbs漂洗5min×3次。dab显色5～15min，流水漂洗中止，mayer氏苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。 　　1.4　结果判断 　　ck10、13、14以胞浆内出现黄色或棕黄色染色为阳性细胞，根据口腔粘膜上皮细胞特点及单抗特异性将染色结果分为： 　　ck10、13:(+)25%～50%基底上层细胞呈阳性；()51%～70%基底上层细胞呈阳性；()70%以上基层上层细胞呈阳性；(-)上皮细胞无阳性。 　　ck14：(+)基底层细胞呈阳性；()基底层和50%以下基底上层细胞呈阳性；()基底层和50%以上基底上层细胞呈阳性。 　　1.5　统计学处理 　　在spss(7.5)统计软件下，将数据作合理合并，结果采用计数资料的结构相对数(%)表示，统计学分析采用行×列χ2检验或fisher's确切概率法。 　　2　结果 　　ck在口腔癌发生发展过程中的蛋白表达，见表2～4。 　　ck10定位于正常舌粘膜上皮基底上层，呈散在分布。随上皮恶程度加深，ck10逐渐增多，在基底上层呈弥漫性分布，正常(含单纯增生)粘膜、异常增生、原位癌ck10的强阳性(～)表达率分别为6.3%、76.9%和100.0%；与正常(含单纯增生)粘膜强阳性率相比，异常增生和原位癌差异均有显著性(p＜0.01)。而至鳞癌阶段，ck10表达突然下降，仅角化珠周边有少量细胞呈阳性着色，强阳性表达率降至12.5%，与正常(含单纯增生)粘膜强阳率相比，差异无显著性(p＞0.01)。本新闻共3页,当前在第1页123 责任编辑：姚红祥

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