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　反义bcl-2寡脱氧核苷酸对bcacd88      

发表时间：2007-1-9 9:40:00

更多保健方面的文章请到中国保健网>>      　　摘　要：目的　探讨与bcl-2翻译起始部位碱基互补的反义bcl-2寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide,odn)对bca-cd885细胞内源性bcl-2表达的阻断作用。方法　以脂质体lepofectin为载体，一过性转染20μmol/l反义及正义bcl-2 odn于bcacd885细胞中，fcm-抗体观测转染后24h、36h、48h细胞内bcl-2基因蛋白表达变化，rt-pcr技术检测转染后24h bcl-2 mrna的表达变化。结果　转染反义bcl-2 odn后24h、36h、48h bcacd885细胞内bcl-2基因蛋白表达与对照组相比都明显下降(p＜0.05)，而正义组与对照组无差异(p＞0.05)；正反义组bcl-2 mrna与对照组相比无明显变化(p＞0.05)。结论　反义bcl-2 odn能在蛋白翻译水平特异性抑制颊癌细胞内源性bcl-2蛋白表达。 　　在细胞中基因的表达通常是由结合蛋白、抑制剂及激动剂所调控的。直到最近才确认调节rna序列可作为基因表达的直接抑制剂。我们以往的研究证明bcacd885颊癌细胞中存在bcl-2表达，且其表达水平与热诱导细胞凋亡存在负相关关系［1］。鉴于此，我们以bcacd885细胞为靶细胞，观察与bcl-2翻译起始部位碱基互补的反义bcl-2寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide，odn)对细胞内源性bcl-2表达的阻断作用。 　　1　材料与方法 　　1.1　主要仪器设备及试剂 　　elite esp型流式细胞仪(美国coulter公司)；uv gds-800凝胶成像分析系统；pcr扩增仪(perkin elmer cetus dna thermal cycler);反义bcl-2 odn：5′-cag cgt gcg cca tcc ttc cc-3′，正义bcl-2 odn; 5′-ggg aag gat ggc gca cgc cgc tg-3′(美国gibco brl公司合成)；脂质体lipofectin(美国gibco brl公司产品)；兔抗人bcl-2多克隆抗体(santa cruz公司产品)，工作浓度1∶50(用0.5% saponin配制)；异硫氰酸胍(fitc)标记的羊抗兔igg(s c公司产品)，工作浓度1∶50(用0.5% saponin配制)；引物(美国gibco brl公司产品)： 　　bcl-2 mrna(385bp)　forward 5′-act tgt ggc cca gat agg cac cca g-3′ 　　reverse 5′-gca ctt cgc cga gat gtc cag cca cca g-3′ 　　β-actin mrna(154bp)　forward 5′-tca tca cca ttg gca atg ag-3′ 　　reverse 5′-gtg ttg gcg tac agg 5-3′ 　　trizol总rna提取试剂(美国gibco brl公司产品)；rt-pcr试剂盒(德国boehringer mannheim公司产品)。 　　1.2　细胞来源 　　人颊癌细胞系bcacd885由华西医科大学口腔医学院提供 　　1.3　实验方法 　　1.3.1　细胞转染［1］　odn的终浓度为20μmol/l，对照组以等体积三蒸水代替odn 　　bcacd885颊癌细胞解冻复苏，取处于对数生长期的细胞，按1×106/ml细胞转种于60mm培养皿中，使细胞达60%～80%的融合。配制溶液a:加40μl odn(10-3 μmol/μl)至360μl无血清培养基中，溶液b：加240μl lipofectin(1mg/ml)至160μl无血清培养基中，合并溶液a和溶液b，轻轻混匀，室温放置15min；弃细胞培养液，用无血清培养基洗涤细胞两次，加1.2ml无血清培养基至lipofectin-odn混合物中(odn的终浓度为20μmol/l)，混匀后，小心滴加于细胞上，轻轻混匀。37°c、5% co2孵箱培养12h；弃转染液，加含10%小牛血清完全培养基继续培养24h、36h和48h。 　　1.3.2　fcm-蛋白质表达测定　收获细胞，吹打制成悬液(1×106细胞/ml)，3%多聚甲醛4°c固定过夜，一抗50μl重悬细胞，4°c反应30min，加50μl fitc标记的二抗，4°c避光反应30min，洗涤后，流式细胞仪检测。以0.5% saponin代替一抗作为阴性对照。 　　1.3.3　rt-pcr［2］　trl zol试剂一步法提取细胞总rna，取5μl作琼脂糖凝胶电泳证明成功。rt-pcr按试剂盒说明并略加改动进行，以β-actin为内参，逆转录后，同时行目的基因和β-actin cdna扩增。反应体系为50μl，包括rt-pcr缓冲液1.5μmol/l mgcl2，1μl酶混合液，0.2mmol/l dntp(each)5mmol/l dtt,5u rnase抑制剂，0.6μmol/l引物(each)，模板ran 0.5～1μg。50°c逆转录30min后行pcr循环：94°c预变性6min，94°c变性45s，62°c退火30s，68°c延伸2min。10s循环以后，每一次循环延伸时间增加10s，再进行25次循环，68°c下充分延伸10min。取10μl rt-pcr产物行1.8%琼脂糖凝胶电泳(含0.5 μg/ml eb)，成像系统紫外成像，密度扫描，分析特异性扩增条带的各强度值。bcl-2 mrna相对量=bcl-2带强度值/β-actin带强度值。本新闻共3页,当前在第1页123 责任编辑：姚红祥

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