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 高温诱导bcacd885颊癌细胞凋亡及      

发表时间:2007-1-9 9:40:00

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       摘 要:目的 探讨热诱导bcacd885颊癌细胞凋亡的动力学改变及热杀伤肿瘤细胞的机理。方法 水浴加温诱导bcacd885细胞产生凋亡。通过细胞形态观察、原位末端标记、dna电泳及流式细胞术dna测定,从形态学、生物化学、分子生物学以及细胞学水平确定凋亡细胞特征。结果 bcacd885细胞经43°c 40min加热,呈现细胞凋亡形态改变,tunel标记见明显的凋亡小体,dna电泳呈现有一定间隔的梯状条带。同时细胞周期发生了明显的特异性改变:g0/g1期百分比增加,s期百分比下降,g2/m期百分比在加热后3h时也发生了明显的下降。45°c 40min加热则出现明显的坏死改变。结论 高温杀伤bcacd885细胞存在细胞坏死和细胞凋亡两种方式,治癌温度是通过诱导细胞凋亡发挥作用。高温诱导bcacd885细胞的凋亡具细胞周期特异性。   vidai和dewey报道热诱导细胞调亡有两个独特的模型:慢死亡和快死亡。慢死亡是指细胞受热后,在失去再生能力之前能够维持生理活动几天,分裂与染色体畸变,多核细胞形成以及有丝分裂异常有关。快死亡是指细胞受热后几天内发生的死亡,其特征是细胞脱离其培养表面。关于快死亡的机制可能与热诱导细胞凋亡有关[1]。本研究以水浴加温诱导颊癌细胞产生凋亡,通过细胞形态观察、原位末端标记、dna电泳及流式细胞术dna测定,从形态学、生物化学、分子生物学以及细胞学水平确定凋亡细胞特征,探讨热诱导bcacd885颊癌细胞凋亡的动力学改变及热杀伤肿瘤细胞的机理。   1 材料与方法   1.1 主要仪器设备   shellab model 2300型自控式co2孵箱(shellab公司);yj-450型超净工作台(苏州净化设备厂);倒置显微镜(日本olympus公司);jem-100sx型透射电镜(日本电子公司);低温高速台式离心机(德国5403型);elite esp型流式细胞仪(fcm)(美国coulter公司);bs2型电热恒温水浴箱(北京医疗设备厂)。   1.2 主要试剂   rpmi 1640培养基(美国gibco brl公司产品);2%苔盼蓝染液;giemsa染液;tunel原位末端标记试剂盒(德国boehringer mannheim公司产品);trizol试剂(美国gibco brl公司产品);碘化丙啶(pi)(美国sigma公司产品)。   1.3 细胞来源   人颊癌细胞系bca cd885由华西医科大学口腔医学院提供   1.4 实验方法   1.4.1 细胞培养 bcacd885颊癌细胞解冻复苏,于含10%小牛血清的rpmi 1640培养基、37°c、5% co2条件下培养。取处于对数生长期的细胞,调整细胞浓度为1×106/ml,按实验分组,接种等量细胞于50ml培养瓶内或放置有盖玻片的60mm培养皿内,使细胞单层生长于盖玻片上,形成细胞爬片,24h后用于实验。   1.4.2 细胞加热 37°c、43°c、45°c水浴40min后,再置37°c、5%co2孵箱中培养12h;43°c水浴40min后,再置37°c、5%co2孵箱中培养0h、3h、6h、12h、24h、48h。   1.4.3 活细胞计数 培养细胞弃培养液,0.25%胰蛋白酶1ml消化10min,弃消化液,加hank's液终止消化,吹打制成细胞悬液,取20μl细胞悬液,加20μl 2%苔盼蓝染液,混匀后行活细胞计数,拒染细胞为活细胞,蓝色细胞为死亡细胞。   1.4.4 细胞形态学检测   (1) 倒置显微镜观察细胞的生长情况及形态变化。   (2) giemsa染色:培养细胞弃培养液,hank's液漂洗3次,取出细胞爬片,4%多聚甲醛(以ph 7.4 0.01mol/l pbs配制)室温下固定30min,giemsa染色10min,自来水冲洗,室温下风干,光镜下观察。   (3) 透射电镜观察:收集细胞,2.5%戊二醛4°c固定24h,1%四氧化锇后固定,丙酮梯度脱水,经包埋剂浸透后环氧树脂包埋,超薄切片,醋酸铀和枸橼酸铅双重染色,透射电镜观察。   1.4.5 tunel原位末端标记 同上固定爬片细胞,pbs洗,0.1% triton-x-100(0.1%柠檬酸配制)4°c打孔5min,pbs洗,加50μl tunel反应混合液(由末端脱氧核苷酸转移酶液和荧光素标记液按1∶1配成),37°c孵60min,pbs洗,加50μl碱性磷酸酶抗荧光素抗体,37°c孵30min,室温下50μl快红显色10min,pbs洗后封片,光镜下观察。以pbs代替末端脱氧核苷酸转移酶液为阴性对照。本新闻共4页,当前在第1页1234 责任编辑:姚红祥

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