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摘要 目的:研究从spf大鼠口腔中分离的内源性血链球菌是否可以阻止或减少牙周可疑致病菌牙龈卟啉单胞菌p.g381在口腔的生长和定植。方法:选用10只spf大鼠分作2组,强力霉素口腔清扫7 d以后分别接种内源性血链球菌和p.g381,二者均获稳定定植。接着选用30只spf大鼠经强力霉素口腔清扫后随机分作a～f6组,其中a、b两组先接种p.g381 5 d,c、e两组先接种血链球菌5 d;然后a组再接种血链球菌5 d,c、d两组接种p.g381 5 d,f组作为阴性对照。接种完成后分别于12 h、24 h、36 h、7 d和14 d采集龈下菌斑标本检测内源性血链球菌和p.g381定植水平。结果:先定植和重复感染的内源性血链球菌在较短的时间内(36 h内)可以减少p.g381的定植水平。这并非是由于24 h或36 h以后血链球菌水平下降所致,因为整个实验中血链球菌始终保持稳定的定植水平。结论:血链球菌不仅要具备定植于口腔的能力,更重要的是能在活体有效地发挥其拮抗作用,才能作为牙周病的效应菌。
微生物学调查结果表明健康牙周龈下微生物以革兰氏性球菌和杆菌为主,而在牙周病变部位则聚集了较多的革兰氏阴性致病菌［1］。定居于牙周健康部位的某些细菌具有抑制牙周可疑致病菌定植和生长的能力,它们是维护牙周健康的有益菌［2～4］。利用这些有益菌的细菌干扰作用,在患者口腔中建立起有益于牙周健康的生理菌群,可望达到生态防治牙周病的目的。
血链球菌是重要的牙周有益菌,它在牙周健康部位检出率较高而在牙周病变部位检出率较低甚至缺乏［2,5］。体外实验证明它对大多数牙周可疑致病菌如牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌等都具有抑制作用［6,7］。如果体内实验证实血链球菌对致病菌具有拮抗作用,就可以利用它来控制龈下微生物组成,达到防治牙周病的目的。本实验研究血链球菌和牙龈卟啉单胞菌在spf大鼠口腔中的相互作用,为牙周病的生态防治提供依据。
1 材料和方法
1.1 血链球菌和牙龈卟啉菌在spf大鼠口腔的定植
选用10只5周龄wistar品系spf大鼠,随机分为a、b两组。首先用强力霉素灌胃,每天每只大鼠给药200 mg,连续给药7 d;然后在a组大鼠口腔接种1.0×109 cfu/ml(cfu,colony-forming unit 集落形成单位)浓度的内源性血链球菌,每只大鼠每天给予1 ml,连续给菌5 d;b组大鼠用灌胃针经胃给予同样浓度的牙龈卟啉单胞菌,每只大鼠每天给予1 ml,连续给菌5 d。其中内源性血链球菌为给药前从普通大鼠口腔分离得到,牙龈卟啉单胞菌p.g381由华西医科大学口腔重点实验室提供。在第5天细菌接种完成后的12、24、36 h,7 d以及14 d,对血链球菌和牙龈卟啉单胞菌在各组的定植水平进行定量检测。
1.2 血链球菌和牙龈卟啉单胞菌在spf大鼠口腔中的相互作用
选用30只5周龄wistar spf大鼠,随机分作6组(表1)。首先每只大鼠每天给予200 mg强力霉素,连续给药7 d。然后a组和b组大鼠每天灌胃接种牙龈卟啉单胞菌(1.0×109 cfu/ml)1 ml,c组和e组大鼠每天口腔接种内源性血链球菌(1.0×109 cfu/ml)1 ml,各组均连续接种5 d。接着,a组大鼠再口腔接种内源性血链球菌(1.0×109 cfu/ml),每日1 ml连续接种5 d,c组和d组大鼠灌胃接种牙龈卟啉单胞菌(1.0×109 cfu/ml),每日1 ml连续接种5 d。f组大鼠为阴性对照组。在接种完成后的12、24、36 h、7 d和14 d时,对各组大鼠口腔中血链球菌和牙龈卟啉单胞菌定植水平进行定量检测。
1.3 内源性血链球菌的分离、鉴定、培养及制备
表1 血链球菌和牙龈卟啉单胞菌在spf大鼠口腔中相互作用的实验设计
组别
处理方法
强力霉素
先接种
重复感染
a
+
牙龈卟啉菌
血链球菌
b
+
牙龈卟啉菌
-
c
+
血链球菌
牙龈卟啉菌
d
+
-
牙龈卟啉菌
e
+
血链球菌
-
f
+
-
-
从普通大鼠口腔采集牙菌斑标本,选择凸出的粘性菌落进行分离纯化,按以下标准进行鉴定:革兰氏染色镜检为革兰氏阳性卵圆形链球菌,触酶反应阴性,能酵解葡萄糖、乳糖、水杨素和海藻糖,水解精氨酸和七叶苷,能产生3-羟基丁酮和过氧化氢,能形成葡聚糖。将该分离株接种于py培养基中生长24 h后,离心收集,pbs清洗,置入15%阿拉伯树胶中配成1.0×109 cfu/ml浓度的菌液,每只大鼠每日口腔给菌1 ml,使它在大鼠口腔定植。
1.4 牙龈卟啉单胞菌p.g381的培养及制备
将牙龈卟啉单胞菌于py培养基中厌氧培养2 d后离心收集,pbs清洗,然后分散于15%阿拉伯树胶中配成1.0×109 cfu/ml浓度,每只大鼠用灌胃针经胃给菌［8,9］,每日1 ml,使它在大鼠口腔定植。
1.5 血链球菌和牙龈卟啉单胞菌定植水平的定量检测
用无菌刮匙和棉签去除龈上菌斑以后,用两根无菌纸尖分别置于大鼠磨牙的近中颊侧和远中颊侧龈下10 s来采集龈下菌斑标本。接种完成后12 h采集a区第一磨牙龈下菌斑,24 h采集b区第一磨牙,36 h采集c区第一磨牙,7 d采集d区第一磨牙,14 d后采集a区第二磨牙标本。将采样纸尖置于1 ml转送液中,振荡分散30 s,按10倍系列稀释法稀释,取各稀释度样本液0.1 ml,分别接种于kv培养基(类杆菌选择培养基)和ms培养基(链球菌选择培养基),37℃厌氧培养48 h后进行cfu计数。
1.6 统计学分析
采用t检验检测各组大鼠两种细菌的定植水平差异。
2 结 果
2.1 血链球菌和牙龈卟啉单胞菌的定植
在使用强力霉素后,接种两种微生物以前,未查到血链球菌和牙龈卟啉单胞菌。接种完成以后,从12 h开始的整个观察期内血链球菌和牙龈卟啉单胞菌均获得稳定定植(图1)。
图1 血链球菌和牙龈卟啉单胞菌在spf大鼠口腔中的定植水平
2.2 血链球菌和牙龈卟啉单胞菌在spf大鼠口腔中的相互作用
①先接种牙龈卟啉单胞菌的a组,在大量血链球菌的进入后,大鼠口腔中的牙龈卟啉单胞菌水平在24 h内有所下降,但是36 h以后,a组和b组牙龈卟啉单胞菌定植水平未见明显差异。②先接种血链球菌的c组,在短期内(36 h内)可减少牙龈卟啉单胞菌的定植水平,但是7 d后,c组和d组牙龈卟啉单胞菌水平未见明显差异。c组后接种的牙龈卟啉单胞菌不能减少血链球菌的定植水平。③c组和e组血链球菌定植水平未见明显差异(表2)。
表2 血链球菌和牙龈卟啉单胞菌在spf大鼠口腔中的定植水平(cfu/ml)
项目
12 h
24 h
36 h
7 d
14 d
牙龈卟啉单胞菌的定植水平
a
3.996±0.380*
4.381±0.277*
4.257±0.420
5.004±0.664
4.936±0.577
b
4.762±0.466
4.911±0.456
4.410±0.442
4.851±0.374
4.740±0.485
c
3.581±0.802*
3.920±0.278*
3.556±0.763*
4.536±0.289
4.905±0.572
d
4.556±0.440
4.911±0.695
4.930±0.740
4.961±0.554
4.632±0.489
血链球菌的定植水平
a
4.727±0.380
4.645±0.365
4.550±0.519
4.786±0.632
4.882±0.383
c
5.317±0.264
5.176±0.265
4.817±0.426
4.857±0.159
4.894±0.421
e
5.232±0.563
5.207±0.603
5.089±0.294
4.965±0.319
5.026±0.255
以上数据先用对数转换后用±s表示 p＜0.05
3 讨 论
1982年hillmen和socransky发现青少年牙周炎患者口腔中伴放线放线杆菌与血链球菌之间存在着拮抗作用［2,3］。基于这一发现,人们认识到血链球菌有可能是保护牙周健康的有益菌。有研究表明,一株能产生过氧化氢的野生型血链球菌具有使定植于无菌鼠口腔中的伴放线放线杆菌定植水平下降25倍的能力［10］。有效地替代有赖于效应菌的成功定植,目前有关血链球菌在人类口腔的定植实验研究较少。westergren等［11］曾报道将同源及异源血链球菌成功定植于健康受试者口腔;在另一些学者的实验中,无论健康人或是难治性牙周炎患者口腔中,血链的定植均未获成功［3］。以上的这些研究都试图用对机体无毒力的效应菌来竞争抑制致病菌以达到替代治疗的目的。而在fiehn等［4］的研究中,作者首先使用广谱抗菌素强力霉素对spf大鼠口腔中的菌群进行清扫,然后再给大鼠接种内源性的血链球菌。其研究结果表明,先接种的血链球菌能减少牙龈卟啉单胞菌p.g381导致的牙槽骨吸收和免疫反应,对spf大鼠具有保护作用。
本实验同样先采用广谱抗菌素强力霉素对spf大鼠进行口腔清扫,抑制大鼠口腔中的微生物,从而使血链球菌和牙龈卟啉单胞菌381在spf大鼠口腔中获得成功定植。先定植和重复感染的血链球菌均具有减少牙龈卟啉单胞菌381定植水平的能力。但这种减少只维持了较短的时间,36 h。但这并不是由于36 h后血链球菌水平下降所引起的,在整个实验中链球菌始终保持稳定的定植水平。本实验表明,要将血链作为效应菌,不仅需要它在口腔中的成功定植,更重要的是它能在活体有效地发挥拮抗致病菌的作用。
血链球菌对牙周致病菌的拮抗机理主要在于它能产生过氧化氢,这已被大量的体外实验所证明。丙酮酸氧化酶是血链球菌产生过氧化氢的关键酶,这种酶的激活需要硫氨焦磷酸(tpp)、黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)和正磷酸盐,其活性可受到氧张力、葡萄糖浓度和一些阳离子的调节［12］。但是关于血链球菌能否有效地在活体产生过氧化氢,血链球菌在活体产生过氧化氢的调节机制尚待进一步研究。
责任编辑：姚红祥
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