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　反转录pcr检测胶质源性神经营养      

发表时间：2007-1-6 12:27:00

更多保健方面的文章请到中国保健网>>     摘要　　目的：探讨牙齿正常状态和炎症过程早、中、晚期胶质源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, gdnf)的基因表达变化。方法：在大鼠牙髓炎模型上，分别摘提取正常鼠及炎症鼠早、中、晚期的尾侧亚核,提取总rna,用rt-pcr一步法扩增gdnf mrna,琼脂糖凝胶电泳照像。结果：正常鼠尾侧亚核gdnf mrna有一定水平的基础量表达；炎症急性期gdnf mrna表达量略有下降；炎症修复期gdnf mrna表达量上升至高峰后回落至高于基础表达量的水平。结论：牙髓炎修复期gdnf在尾侧亚核f的表达增高，提示gdnf可能参与炎症牙髓神经修复再生过程，对神经末稍再生发芽有促生长作用。　　　　胶质源性神经营养因子 (glial cell line-derived neurotrophic factor ，gdnf)是新近发现的神经营养因子家族成员之一，其较ngf具有更强的促神经再生能力［1,2］。gdnf除存在于神经系统外，还存在于感觉神经丰富的器官如：牙齿、眼、鼻。牙髓神经快速生长期gdnf在牙胚组织表达较强，可诱导三叉神经向髓腔伸长，并对牙髓神经的发育起重要促进作用［3］。有关在炎症状态时gdnf表达是否改变及其与牙髓神经再生修复的关系目前尚未见研究报道。本实验利用rt-pcr技术研究正常鼠和牙髓炎症鼠的不同时期gdnf在牙髓神经中枢尾侧亚核表达量变化，探讨gdnf是否参与炎症修复期牙髓神经再生，及其在牙髓炎症反应中的作用。 1　材料和方法1.1　材料　　高速低温离心机(sigma 2mk)；eppendorf pcr仪(germany)；烤箱(101-2型，上海实验仪器厂)；水平电泳仪(上海实验仪器厂)；紫外灯显像及照像系统(model 2f-3，上海实验仪器厂)。　　trizol总rna提取试剂盒(gibco usa)；一步法rt-pcr试剂盒(gibco usa)；pcr marker(华美生物工程公司)；depc水，(gibco usa)。1.2　方法1.2.1　鼠牙炎症模型建立和分组　　运用5g/l的α－内毒素（sigma公司，usa）作用在鼠牙右侧的穿髓点15min，然后用玻璃离子水门汀封闭制做炎症牙髓模型［14］。按封药后观察时间的长短分3d组、6d组、9d组、12d组，以及正常鼠牙组共5组。 此模型特点为牙髓存活时间长，牙髓组织有足够时间参与免疫应答及免疫防御过程，机体有足够时间展示修复再生功能［4］。1.2.2　尾侧亚核总rna的抽提　　不同时间点处死动物，心脏灌注后开颅取双侧尾侧亚核。将各组的尾侧亚核放入2ml的匀浆器，加入1ml trizol变性液中充分匀浆，异丙醇沉淀，氯仿抽提，750ml/l乙醇洗去盐份，所得的沉淀物用30μl depc处理过水溶解，取其中5μl释液100倍后测a260、 a280 、 a230 ，a260/a280>1.7, a260/a230>1.5，若低于1.7、1.5的标准线，表示有蛋白质污染和盐分残存。1.2.3　引物设计（第四军医大学神经生物研究所，宋俊峰博士惠赠）　　由军科院八所合成，其序列5'端引物5'-tca cca aaa caa atg gca gtg-3',3'端引物5'-gga cga ctc aga tac cac acc ttt tag-3'5'端引物3'端引物浓度为25pmol.1.2.4　一步法rt-pcr　　在50μl反应体积中含引物p1引物p2各1μl，mgso43μl,2×反应缓冲液25μl(内包括四种ntp各0.4mmol)，加模板1ng 根据a260=1 的 rna 溶液每豪升约含40μgrna，计算出各组模板量1ng所需的体积数，加depc处理过水至49μl，后94℃，5min，放冰浴骤冷从而可减少dna的二级结构形成，然后加rt/tag混合酶1μl， 后加石蜡油20μl覆盖，以避免反复升温所致的水分的散失。各样品在55℃孵育，30min，反转录cdna链后,进入pcr程序(94℃，3min，杀灭不耐高温的反转录rt酶的活性后，按94℃，40s，55℃，1min，72℃，1min顺序循环30次，72℃延伸5min，温度降至4℃)。待pcr完成， 样品移至-20℃冰箱保存。　　样品制备完成后取样10μl,20g/l琼脂糖凝胶电泳检测正常组，炎症3d组，炎症6d组，炎症9d组，炎症12d组pcr产物量本新闻共2页,当前在第1页12 责任编辑：姚红祥

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