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　转染骨形成蛋白2基因对细胞凋亡      

发表时间：2007-1-6 12:27:00

更多保健方面的文章请到中国保健网>>     摘要　　目的：探讨骨形成蛋白(bmp)与细胞凋亡的关系及意义。方法：利用脂质体转染方法将bmp2真核表达载体pbk-b2导入nih3t3 细胞，通过g-418筛选获得阳性细胞克隆。细胞原位杂交和免疫组化检测bmp2基因的稳定转染及表达，并利用tunel法观察细胞凋亡情况。结果：bmp2基因成功导入nih3t3细胞并得到表达。转染细胞的凋亡细胞阳性率与未转染细胞相比有显著性差异。结论：bmp2能够诱导细胞凋亡，且这种作用与细胞所处的生长分化状态密切相关。 　　　　细胞凋亡是从低等动物到高等动物整个生物界中一个共有的规律性现象，是由内在基因编码的主动编程性死亡，同时还包含着不同的启动机制和运行通路。越来越多的证据表明，程序性细胞死亡受到一些因子的控制，这些因子同时也控制着细胞的转化、分化及细胞周期等［1］。其中bmp在细胞凋亡中也扮演了重要的角色［1］。目前的研究认为，bmp不再是单纯的骨诱导因子，而是具有多种生物学功能的分化蛋白。为了进一步探讨bmp与细胞凋亡的关系，本实验将bmp2真核表达载体转染至成纤维细胞内，观察它对细胞凋亡的影响并探讨其意义。1　材料和方法1.1　主要材料　　bmp2真核表达质粒pbk-b2由本室构建［2］。小鼠成纤维细胞株nih3t3由本校免疫学教研室金伯泉教授惠赠。lipofectamine转染试剂盒购自北京东方科技公司。dmem、g-418为美国gibco公司产品。细胞甩片机cytospin 3 为英国shandon公司产品。tdt-mediated dutp nick end labeling (tunel) kit购自美国oncor公司。 1.2　基因转染和克隆筛选　　采用脂质体载体（lipofectamine）将pbk-b2转染nih3t3细胞。转染3d后，弃去原培养液，加入含g-418 500mg/l 的dmem培养液（含100ml/l fcs），在标准环境下培养，15d后绝大多数细胞死亡，收集g-418抗性的细胞克隆，扩大培养并制备细胞爬片，固定于40g/l多聚甲醛（pfa）/pbs (ph 7.4)中。1.3　原位杂交［3］　　细胞爬片经3ml/l triton x-100/ pbs、0.2、0.1mol/l hcl及蛋白酶k处理，40g/l pfa后固定及逐级酒精脱水干燥后，滴加热变性后的含地高辛标记bmp2探针的杂交液(不含bmp2探针的杂交液作空白对照)，42℃杂交过夜。2×ssc、1×ssc、0.5×ssc充分漂洗，正常羊血清封闭，然后滴加标记碱性磷酸酶的抗地高辛抗体（anti-dig-ap）37℃温育2h。bufferⅰ、bufferⅲ充分漂洗后，nbt/ bcip暗处显色20h。te终止反应，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。1.4　免疫组化［4］　　细胞爬片经10ml/l 过氧化氢/ pbs、3ml/l triton x-100/ pbs处理后，滴加正常羊血清37℃温育30min，弃去血清后滴加鼠抗人bmp2单抗(以pbs替代bmp2单抗作为空白对照)，4℃过夜。滴加生物素化的羊抗鼠igg，37℃温育30min，滴加abc复合物37℃温育30min，上述各步之间均以pbs充分振洗。最后浸入新鲜配制的dab显色液，室温10min，蒸馏水洗终止反应，苏木精衬染，逐级酒精脱水后二甲苯透明，中性树胶封片。1.5　制备细胞甩片　　分别培养转染细胞和未转染细胞至对数生长期，2.5g/l胰酶消化后，用细胞甩片机以1000r/min离心3min，40g/l pfa/ pbs (ph7.4)固定40min，4℃保存备用。1.6　细胞凋亡检测（tunel法）　　细胞甩片在3ml/l triton x-100/ pbs中，37℃孵育15min；pbs (0.05mol/l, ph 7.5)洗涤后，在30ml/l过氧化氢/pbs中37℃孵育5min； pbs洗涤后擦干切片周围，加25μl 平衡buffer，37℃孵育1min，擦干切片周围，加25μl tdt酶(以pbs替代tdt酶作为空白对照)，37℃孵育2h后，加入37℃预热的中止buffer，37℃孵育30min，每10min更换中止buffer 1次；buffer ⅰ洗涤，正常羊血清37℃封闭30min；加anti-dig-ap 37℃孵育2h，bufferⅰ洗涤后buffer ⅲ洗涤5min，nbt/ bcip显色4h，蒸馏水中止反应，脱水、透明、中性树胶封片。在40×光镜下，随机选取6个视野（向同一方向移动切片，不重复不重叠）进行阳性细胞计数并计算阳性细胞率，利用统计学软件（statgraphics version 3.0）进行二组间统计学分析。本新闻共2页,当前在第1页12 责任编辑：姚红祥

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