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　人牙髓细胞smad2基因mh2结构域的      

发表时间：2007-1-6 12:27:00

更多保健方面的文章请到中国保健网>>     摘要目的：从人牙髓细胞内克隆转化生长因子-β特异的细胞内信号转导基因smad2的功能性结构域——mh2结构域。方法：原代培养人牙髓细胞，从培养的细胞中提取总rna，逆转录合成cdna第1条链；设计内、外侧两对引物，进行巢式pcr，扩增smad2基因mh2结构域的基因片段；将所获得的基因片段定向插入pbluscript ⅱ sk(+)载体；转化大肠杆菌jm109，挑选阳性克隆并鉴定；用pe317-a型自动测序仪进行核苷酸序列测定分析。结果：测序结果与国外从人肾cdna文库中克隆的基因序列完全一致。结论：首次从人牙髓细胞中克隆成功smad2基因的mh2结构域，证实了smad2基因在人牙髓细胞中的表达；提示人牙髓细胞内存在smad2信号转导途径，tgf-β对人牙髓细胞分化的调节可能是通过smad2信号转导途径实现的。 　　转化生长因子β(transforming growth factor β，tgf-β)在成牙本质细胞分化和第三期牙本质的形成过程中起着重要的、甚至是关键性的调控作用［1～7］。但其作用的分子机制，即tgf-β在成牙本质细胞和牙髓细胞内的信号转导途径及其对基因表达的调控方式一直未能阐明。1996年，国外从人肾cdna文库中克隆成功一种特异地转导tgf-β信号的细胞内信号转导基因smad2［8］。smad2基因的发现，是tgf-β信号转导研究的一个突破性的进展。　　目前，有关人牙髓细胞内是否存在smad2基因的表达和smad2基因在第三期牙本质形成中的作用等研究的报道甚少。本文采用逆转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)的方法，从培养的人牙髓细胞中克隆smad2基因的功能性结构域——mh2结构域，并测定其核苷酸序列，旨在从细胞内信号转导的水平探索牙髓细胞分化和第三期牙本质形成的分子机制。1　材料和方法1.1　组织块法原代培养人牙髓细胞　　选择健康青少年(13岁，男)因正畸拔除的上颌第二前磨牙，取其正常的牙髓组织，组织块法［9］原代培养人牙髓细胞。培养液为含15%胎牛血清（fcs）的dmem培养液(gibco,usa)。将第6代细胞用于实验。1.2　总rna的提取　　收集约1×105个第6代人牙髓细胞，用total rna extraction system(华美公司)提取总rna,溶于35μl 去离子水中。取5μl rna，加入500μl 去离子水稀释，分光光度法测定其a260和a280，以确定rna的纯度和含量。1.3　cdna的合成　　取5μl rna用1st strand cdna synthesis kit for rt-pcr(amv)(宝灵曼公司，德国)合成cdna第一条链。1.4　巢式pcr　　通过因特网联网检索genbank, 获得smad2 cdna序列。以smad2基因的mh2结构域为模板，用oligo软件辅助设计引物。共设计外侧、内侧两对引物，分别为p1、p2和p3、p4。p1(外侧5'端引物)：5'-ctcctactacgctttcccctgtt-3';p2(外侧3'端引物)：5'-agaagagttgttacattaagtcttt-3';p3(内侧5'端引物)： 5'-ccgaattcatagcttggatttacagccagt-3'，带ecorⅰ酶切位点；p4(内侧3'端引物)：5'-gtctctcgagttccattggacttgattggtgaag-3'，带xhoⅰ酶切位点。合成引物(赛百盛公司)。用pwo dna polymerase（宝灵曼公司，德国）进行巢式pcr。第一轮反应：10×pcr buffer(20mmol/l mgso4)5μl,dntp 4μl,pwo 酶0.6μl,cdna模板2μl,引物p1、p2各3μl，加水至50μl。反应条件：94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸50s，30个循环。以第一轮pcr的产物为模板，p3、p4为引物，进行第二轮pcr。反应条件：94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸50s，5个循环；94℃变性30s,63℃退火45s，72℃延伸50s，30个循环。1.5　pcr产物的回收、克隆　　第二轮pcr产物于10g/l低熔点琼脂糖凝胶上电泳，用advantagetm pcr-pure kit (clontech labratories inc. usa)回收目的基因。ecorⅰ和xhoⅰ分别对回收的目的基因和载体pbluescript ⅱ sk(+)进行双酶切消化，连接目的基因和载体，转化大肠杆菌jm109，蓝白筛选阳性克隆pbs/s2mh2，用ecorⅰ和xhoⅰ进行酶切鉴定。本新闻共3页,当前在第1页123 责任编辑：姚红祥

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