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　人牙本质基质蛋白1 cdna序列的克      

发表时间：2007-1-6 12:27:00

更多保健方面的文章请到中国保健网>>     目的：克隆人牙本质基质蛋白1( dmp1)成熟肽编码区基因片段。方法：用异硫氰酸胍一步法从引产胎儿牙乳头组织中抽提总rna，用oligo(dt)作引物逆转录合成牙乳头cdna，然后利用pcr方法，从cdna中扩增出人dmp1成熟区的基因片段(约1.8 kbp)，将所得基因片段插入pbluescript质粒载体，转化到大肠杆菌xl1-blue后挑选阳性克隆，提取重组质粒dna，通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到人dmp1成熟肽编码区基因片段。　　关键词　 牙本质基质蛋白1；聚合酶链反应；人　　　　牙本质基质蛋白1(dental matrix protein 1，dmp1)是牙本质基质非胶原蛋白的主要成员之一，为成牙本质细胞合成的磷酸化蛋白质。它不仅是成牙本质细胞重要的表面标记，而且在牙本质生物矿化中具有成核作用，调节矿化晶体的形态和生长速度，起着维持矿化组织的重要作用［1］。本文采用逆转录pcr方法，从合法引产胎儿切牙、尖牙和前磨牙牙乳头组织中克隆到dmp1 cdna基因片段，并测定了其部分核苷酸序列。1　材料和方法　　本组所用9月龄胎儿为合法引产胎儿。无菌条件下暴露前磨牙部位，挑开牙龈组织，挖取乳切牙、乳尖牙和乳前磨牙［2，3］，立即置液氮中冻存，-70℃下长期保存。　　根据hirst［4］等报道的人dmp1的cdna序列，采用pc gene 设计pcr扩增的两条引物。5'和3'端引物序列为：5'aagaattctacggagggtagaggtatcacacc3'，带有ecori酶切位点；3'端的引物序列为5'aaaggatcctgcagatcctttcttgcttactagc3'，带有bamhi酶切识别序列。　　载体质粒pbluescript ks(pbs)用 smai酶切消化，平端连接目的基因片段和酶切质粒载体。限制性内切酶均购自promega公司。　　逆转录pcr扩增、pcr产物的克隆、酶谱分析和核苷酸分析与郝建军的报道相同［5］。2　结果2.1　总rna　　异硫氰酸胍一步法提取的人牙乳头总rna电泳(图1)，所获得的总rna无明显的降解 　 1.人牙胚组织总rna　　2.小鼠牙乳头组织总r图1　人牙乳头组织总rna琼脂糖凝胶电泳 2.2　rt-pcr　　牙胚组织总rna经rt-pcr扩增后，可见大小约1.8 kbp的特异扩增产物(图2)。 图2　pcr扩增产物dmp1和重组质粒pbs/dmp1酶切图谱琼脂糖凝胶电泳　　1.λdna/hindⅲ　　2.阴性对照(未加重组质粒模板)　　3.以重组质粒为模板的dmp1 pcr产物　　4.重组质粒pbs/dmp1　　5.pbs/dmp1经ecorⅰ和bamhⅰ双酶切　　　　6.载体质粒pbs7.λdna/pstⅰ　　8.目的产物dmp19.阴性产物(未加模板) 2.3　pbs-dmp1克隆的酶谱分析　　重质粒pbs-dmp1经ecorⅰ和bamhⅰ双酶切后为两条带(图2，第5道)，1.8 kbp的dmp1和2.96kbp的载体pbs。1.8 kbp的dmp1与 pcr的目的产物电泳条带(8和3道)平齐，2.96kbp的pbs与空载体pbs(6道)平齐。重组质粒pbs-dsp的酶切图谱与预期的完全一致。apai 酶切pbs-dmp1可获得1.4kbp和3.4kbp两条带，这与文献报道的人dmp1序列的酶切位点完全一致(图3)［4］。 图3　重组质粒pbs-dmp1酶切图谱琼脂糖凝胶电泳　　1　　λdna-pstⅰ　　2,3　重组质粒pbs-dmp1经apai酶切　　4,5　pbs-dmp1经ecorⅰ和bamhⅰ双酶切　　6　　重组质粒pbs-dmp1 2.4　pbs-dmp1克隆的序列分析　　dmp1成熟蛋白编码区基因克隆质粒pbs-dmp1部分核苷酸的测序结果，可读出的200个碱基序列与hirst等［4］报道的结果完全相同。3　讨论　　dmp1是牙本质主要非胶原蛋白的一种，是磷酸化程度高、酸性较强的蛋白质之一。1993年george等［6］在用多抗筛选sd大鼠成牙本质细胞-牙髓成纤维细胞复合体文库时发现了一种新的牙本质基质酸性蛋白，名命为ag1。随后他们［7］又用地高辛标记的核酸探针研究ag1在小鼠染色体的定位，发现其基因位于5q21，与fgf 5紧密相连，为了符合目前染色体命名规则，ag1被更名为牙本质基质蛋白1(dmp1)。本新闻共2页,当前在第1页12 责任编辑：姚红祥

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