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绿茶多酚和氟化钠对变链菌形态学
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发表时间：2007-1-6 12:27:00
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作者单位：上海第二医科大学附属第九人民医院口腔研究所 200011
关键词：氟化钠；变异链球菌；绿茶多酚
〔摘要〕 目的：为深入探讨绿茶多酚防龋机理。方法：以氟化钠为对照，观察了绿茶多酚对变链菌形态学及其蔗糖酶、葡糖基转移酶(gtf)和乳酸脱氢酶(ldh)的影响，同时检测了培养液中蛋白含量和 ph值的改变。结果：绿茶多酚和氟化钠对gtf 均有抑制作用，前者强于后者，而对蔗糖酶影响不明显。绿茶多酚对ldh 无明显影响，不能阻止培养基 ph的下降，对菌液蛋白总量无明显改变；而氟化钠对ldh 有影响，明显减少培养基 ph值的下降，且使菌液蛋白总量明显增加。结论：绿茶多酚对gtf 具有很强的抑制作用，这是其抗变链菌致病作用的主要途径之一。
茶多酚(tea polyphenol)为茶叶的主要成份，约占茶干重的25% ［1］ ，主要构成为儿茶素、表儿茶素、没食子酰表儿茶素、没食子酰表没食子儿茶素等［2］，具有优异的抗氧化性能和显著的清除自由基能力，主要药效表现在降血脂、抗肿瘤、抗菌消炎，抗衰老、抗过敏等作用。有关茶多酚在口腔方面的研究曾有报道［3］，但尚显不充分。深入的机理探讨有助于充分的开发性研究。本研究采用体外实验的方法，以氟化钠为对照，观察了绿茶多酚对变链菌形态学及对其蔗糖酶、葡糖基转移酶和乳酸脱氢酶的影响，同时检测了培养液中蛋白含量和ph 值的改变。
1 材料和方法
1.1 细菌培养
选用国际标准菌株，变链菌族的s.mutans ingbritt和s.sobrinus 6715。采用10 g/l蔗糖的胰蛋白酶消化大豆培养基(tsb)或轻唾琼脂培养基(ms)，厌氧培养18 h (n2、co2 的体积分数分别为90%、5%)、37℃。
1.2 绿茶多酚对变链菌的敏感试验及mic50测定
实验所用药品: 绿茶多酚，购自杭州中科天然植物技术公司，原液128 g/l。氟化钠，原液1 g/l。保存之细菌复苏，经生化鉴定后接种于相应琼脂平板。挑取琼脂表面的单个菌落混悬于相应液体培养基中(每毫升含1 个直径1 mm菌落)培养，培养18 h后使菌液含量为108～109 cfu/l。mic(minimum inbibitory concentration，最小抑菌浓度)测定：用无菌微量加样器吸取呈梯度稀释的各种药品50 μl于无菌96孔微孔板中，再加入等量菌液，混合。放置适宜培养条件下孵育后观察结果。肉眼观察无细菌生长的最低药物浓度为mic。mic50(半数最小抑菌浓度)测定：对mic 前后浓度进行更为密集的稀释，重复抑菌试验。吸取肉眼观察无细菌生长的微孔板中培养物50 μl，接种于相应平板。适当条件下培养后观察，计算各平板的细菌菌落数，其菌落数为阳性对照的50% 的药品的稀释浓度即为对该细菌生长的mic50。阳性对照：不加各种药品，只加菌液和等量液体培养基。阴性对照：不加菌液，只加各种药品和等量液体培养基。
1.3 绿茶多酚对变链菌形态学的透射电镜观察
细菌及培养同前。氟和茶多酚的含量为实验1.2 测得的mic50。培养18 h后离心得菌体，以盐水洗3 次。用马血清37 ℃包被孵育1 h，离心，用体积分数为 2% ph7.4 的戊二醛固定液固定2 h， 4 ℃保存。再用10 g/l四氧化锇后固定，室温保存1 d，醋酸铀染色后经一系列不同浓度的酒精逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，枸椽酸铅染色，hitachi h600 透射电镜下观察。
1.4 绿茶多酚对变链菌胞外蔗糖酶、葡糖基转移酶和乳酸脱氢酶的影响
取含量为108～109 cfu/l 的菌液0.1 ml分别加入1.9 ml含氟或绿茶多酚的培养基中。氟和茶多酚的浓度为实验1.2 测得的mic50。培养18 h后离心得上清液为待测样品。设无药品的培养基、含氟的或含茶多酚的培养基3个实验组。取上述各样品液100 μl，分别按以下原理方法测定酶活性(测得值均减去相应的无菌对照)。酶活性抑制率计算：(无菌组吸光度—实验组吸光度)/无菌组吸光度×100%。
葡糖基转移酶(gtf)：该酶利用蔗糖产生葡萄糖和果糖，通过somogyi 方法测定果糖量可推测酶活性。乳酸脱氢酶(ldh)：ldh在辅酶ⅰ的递氢作用下，乳酸脱氢生成丙酮酸，丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸二硝基苯胺，后者在碱性溶液中呈棕红色。蔗糖酶：蔗糖酶分解蔗糖成等量的葡萄糖和果糖，葡萄糖在碱性加热条件下可以还原3，5-二硝基水杨酸，产生颜色反应，其颜色的深浅与还原糖量成正比。
1.5 绿茶多酚对变链菌培养液蛋白含量和ph值的影响
采用样品同实验1.4, lowry 法测定蛋白含量，用ph s-3c型酸度计测定ph值。同样设未接种细菌的对照组。
2 结 果
2.1 绿茶多酚对变链菌的敏感性及形态学影响
绿茶多酚对s.mutans ingbritt的mic50为0.70 g/l， 对s.sobrinus 6715的mic50为0.40 g/l。氟化钠对s.mntans ingbritt的mic50为0.06 g/l，对s.sobrinus 6715的mic50为0.07 g/l。透射电镜发现：与对照组相比，绿茶多酚对变链菌主要影响为菌壁膜结构破坏，氟化钠主要影响为菌体的胞浆空泡变性(图1)。
a 放大4万倍
b 放大4万倍
c 放大2万倍
d 放大4万倍
e 放大2万倍
f 放大4万倍
图1 绿茶多酚和氟化钠对变链菌影响的透射电镜图像
a：正常 s.mutans, b: 正常s.sobrinus, c: 绿茶多酚作用的s.mutans, d：绿茶多酚作用的s.sobrinus, e: 氟化钠作用的s.mutans, f: 氟化钠作用的s.sobrinus
2.2 绿茶多酚对变链菌胞外蔗糖酶、葡糖基转移酶和乳酸脱氢酶的影响
绿茶多酚和氟化钠对变链菌胞外葡糖基转移酶有明显的抑制作用，且绿茶多酚的抑制作用强于氟化钠。绿茶多酚对乳酸脱氢酶无明显影响，而氟化钠对乳酸脱氢酶有影响。绿茶多酚和氟化钠对变链菌蔗糖酶的影响都不明显(表1)。
表1 绿茶多酚对变链菌胞外蔗糖酶、gtf和ldh的影响［a(吸光度)值，±s,n=5］
酶
细菌
无药品
绿茶多酚
氟化钠
gtf
s.mutans
0.83±0.19
0.27±0.05②
0.45±0.06②
(67.86%)
(46.43%)
s.sobrinus
0.80±0.14
0.16±0.11②
0.32±0.14②
(80.00%)
(60.00%)
蔗糖酶
s.mutans
1.68±0.39
1.00±0.13
1.46±0.31
s.sobrinus
1.05±0.21
0.76±0.14
1.06±0.31
ldh
s.mutans
0.07±0.01
0.05±0.02
0.03±0.01②
(57.14%)
s.sobrinus
0.07±0.01
0.09±0.01
0.03±0.01②
(57.14%) 括弧内为与对照组比较酶活性抑制率
未标：p＞0.05 ① p＜0.05 ② p＜0.01, 下同
2.3 绿茶多酚对变链菌培养液蛋白含量和ph 值的影响
绿茶多酚没能阻止培养基ph的下降，而氟化钠则可明显减少ph值的下降(表2)。加入绿茶多酚菌液蛋白总量与对照无明显差别，而加入氟化钠菌液蛋白总量明显增加(表3)。结合形态学的结果，可以认为蛋白增加是由于菌体的胞浆空泡变性、破坏，胞内蛋白大量混入培养液造成。
表2 绿茶多酚对变链菌培养液ph值的影响
(与无菌组比较ph下降值，±s，n=5)
细菌
无药品
绿茶多酚
氟化钠
s.mutans
2.65±0.08
2.50±0.04
0.53±0.13
s.sobrinus
2.82±0.04
1.51±0.02
0.68±0.18
表3 绿茶多酚对变链菌培养液总蛋白量影响(a值，±s，n=5)
细菌
无药品
绿茶多酚
氟化钠
s.mutans
0.30±0.01
0.31±0.06
1.09±0.41②
s.sobrinus
0.35±0.02
0.40±0.03
0.81±0.44① 3 讨 论
本实验的目的是以氟化钠为对照，分析绿茶多酚对变链菌的影响机理。为使研究具有可比性，首先测定了绿茶多酚和氟化钠对变链菌的mic50，相同mic50即代表了两者具有相同的抑菌程度。分析对细菌影响的机理，检测其代谢过程中的酶是一重要的方法。对菌体酶的分析需要离心、清洗和破壁等过程，影响精确的定量研究。而细菌代谢过程的一些酶是可分泌到培养液中的，如葡糖基转移酶就是一种公认的胞外酶。因此，本实验采用测定培养液中酶活性，以无菌培养液为对照，排除培养基的影响，分析绿茶多酚对变链菌的影响机理。
乳酸脱氢酶(ldh)是细菌的一种固有酶，此酶总是以高浓度存在于细胞内，但也分泌于牙菌斑中［4］，通过直接测定菌体悬液可分析其活性［5］。葡萄糖是细菌碳源的主要碳水化合物，其他糖类代谢的分解途径也常同葡萄糖代谢有联系。葡萄糖的厌氧代谢主要途径之一是embden-meyerhof代谢途径(简称e－m途径)。ldh 就是这一代谢过程中的一个重要酶，它的作用是催化丙酮酸和乳酸的相互转化。当细菌与高浓度糖接触时，丙酮酸降解生成乳酸。丙酮酸和乙酸、丙酸等酸的pka(酸的解离常数的负log值)值都较乳酸高，所以乳酸对ph值的影响最大。由此可见，在糖充足的情况下，ldh活性对ph值的影响更大。这可解释本实验的结果，绿茶多酚对ldh 活性影响不明显，培养液ph值的下降程度同对照相似，而氟化钠对ldh 活性影响明显，培养液ph值的下降就不大。但是，ldh催化丙酮酸和乳酸的转化有双向性。在外源性糖缺乏的情况下，ldh 可催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸进一步由丙酮酸甲酸裂解酶降解成甲酸、乙酸和乙醇，供给细菌能量。不仅如此，饥饿菌斑的有机酸分析表明，主要的酸是甲酸、丙酸等，ph为中性；一旦菌斑与糖接触乳酸量明显增加，ph值快速降低［6］。由此可认为，在机体情况下ldh 的作用也是双向的，有糖时使乳酸大量生成导致菌斑ph值降低；无糖时又可催化乳酸生成丙酮酸减少乳酸在牙菌斑中的堆积而使菌斑ph值回升。因此，有学者提出ldh 是菌斑中的一个减龋因子［7］。如何评价ldh 在龋病发生的地位，有待进一步深入的分析，但ldh 与菌液ph的关系被本实验印证。变链菌族的s.mutans(变形链球菌)和s.sobrinus(又称远缘链球菌)是最主要致龋菌，这些致龋菌的gtf是一种固有的胞外酶，其催化蔗糖合成的细胞外葡聚糖是一重要的毒力因子。葡聚糖的产生则是形成牙菌斑，导致牙齿脱矿，发生龋齿的基础。因此，gtf 酶活性是判断细菌致龋力的重要指标。本实验证实绿茶多酚对gtf 具有很强的抑制作用，可认为绿茶多酚对gtf 的抑制作用是其抗变链菌致病作用的主要途径之一。
总之，本研究比较了绿茶多酚和氟化钠对变链菌作用机理，证实其对gtf 和ldh 以及形态学的影响存在着差异。有关其对细菌作用机理的更为完整、详细的资料，还需进行对细菌代谢多种酶的深入分析和相关分析化学方法的应用。
参考文献
1 陈为钧，万圣勤. 茶多酚主要药效情况. 中草药， 1993,24:493
2 于新蕊，曲 军，从月珠. 茶叶的化学成份及药理作用研究进展. 中草药，1995,26：219
3 李鸣宇，刘 正. 茶多酚对口腔咽喉主要致病菌作用的体外实验. 上海第二医科大学学报. 待发表
4 周学东，李继遥，胡 涛. 不同年龄人牙菌斑糖代谢酶的活性比较. 华西口腔医学杂志，1997,15(3)：190
5 张宽厚. 细菌生理学实验. 见：张宽厚主编. 细菌生理学. 北京：人民卫生出版社，1963.281
6 刘天佳. 牙菌斑的生物化学. 见：周学东主编. 口腔生物化学. 成都：华西医科大学，1994.91
7 higham sm, edgar wm. effect of lactatedehydrogenase on fissure caries in rats. caries res,1990,24:39本新闻共2页,当前在第1页12
责任编辑：孙昕
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