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　口腔组织工程基础与应用展望      

发表时间：2006-11-28 10:47:00

更多保健方面的文章请到中国保健网>>     “组织工程”一词是美国国家科学基金会于1987年正式提出和确定的。在人体内器官里的细胞附着在细胞外基质支架上，以便从邻近的毛细血管获得氧和营养物质并排出代谢产物。因此，构建一个具有活体组织功能并含有活细胞的组织、器官样结构，需要合理的细胞支架以及细胞代谢机制。所以组织工程的基本原理和方法是将体外培养的组织细胞吸附扩增于一种生物性能良好并可被人体逐步降解吸收的生物材料支架上，形成细胞-生物材料复合物。该生物材料支架为细胞提供了一个三维生存空间，有利于细胞获得足够的营养物质，进行营养物质交换，并且能排除废物，使细胞能按照预测设计在三维支架上生长。然后将此细胞-生物材料复合体植入机体组织病损部位。植入的细胞在生物支架逐步降解吸收过程中，继续增殖并分泌基质，形成新的具有与自身功能和形态相应的组织和器官。这种具有生命力的活体组织能对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代的目的。（如图1所示） 　　现代组织工程技术在细胞成分相对较为单一的组织重建中已获得了初步的成果，比如皮肤、骨、软骨、神经、肌腱的组织再生，已逐渐从实验室走向临床应用。但是对于同时涉及到多种类型细胞并具有规整结构的复杂组织重建却仍然面临着许多困难，其中组织工程化牙齿的研究具有一定的代表性。牙齿的发育过程主要是由上皮和间充质相互作用控制的，在蕾状期及此前，牙源性上皮起诱导决定作用，到了蕾状期后这种诱导决定作用转移到了间充质一方（牙乳头），一直到钟状晚期，这种诱导能力依然存在。与此同时，牙齿的发育也是生长因子家族成员反复表达的累积结果。因此传统的组织工程技术面临着很大的困难，仅仅依靠在组织工程支架上分泌基质的普通成体细胞是无法重建牙体组织的，我们需要诱导细胞重演组织发生的过程，或者至少是诱导装置内多种细胞相互作用从而导致组织组装成型。这其中的重点是如何找到具有多向分化潜能的“干细胞”，如何通过调控基因的表达以及利用细胞间相互作用、细胞与支架材料和生长因子的相互作用来达到组织再生的目的。这些问题的解决将有赖于基因组、蛋白质组和细胞组研究以及生物材料科学研究的进一步深化，有赖于对生命的本质、起源、进化有更为深入的了解。未来，这种构建的组织不仅要能够生长并填满受损的病变组织以及与母体组织相融合，而且还可以随着身体生长的变化而一同变化。一、组织工程支架材料　　 组织工程支架材料是指能与组织活体细胞结合并能植入生物体的材料，它是组织工程化植入体的基本构架。组织工程支架材料的基本作用是为细胞提供附着点，使植入体具备力学稳定性，为新形成的组织提供基本的结构框架，同时也是组织工程植入体对生理变化作出反应的平台，并作为一种细胞外基质参与和周围组织的结合。理想的组织工程材料应具备以下条件：1.支架应为三维、多孔网络结构，孔的尺寸应能允许细胞的生存，且孔间应相互贯通，以利于营养物质和细胞代谢产物传送；2.良好的生物性能和生物降解性，降解速率应能与新组织的生长相匹配；3.表面应有利于细胞粘附和正常的分化和增殖；4.具有一定的生物力学性能，与所修复组织相匹配；5.可以携带生长因子等生物活性物质。　　组织工程材料的制备通常有以下几种方法：无纺织物／纤维粘结法、溶液浇铸／粒子洗出法、相分离/冻干法、气体成孔法、三维“印刷”法等。　　（一） 非生物降解性高分子材料　　 非生物降解性高分子材料包括聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚硅氧烷、聚氨脂和聚四氟乙烯等。主要用于制作组织工程化软、硬组织，人工器官，人造血管等的支架材料。　　（二） 生物降解型高分子材料　　 生物可降解性高分子材料，特别是生物可降解与吸收性材料，是组织工程支架材料的发展方向和趋势。由于其降解特性，使组织工程支架可以随着组织的新生而逐渐消失，及时地为新组织的生长提供了必要的空间，使组织在形成过程中逐步得到应力载荷的锻炼，并且避免了需二次手术将支架材料取出。在组织工程中常用的生物降解型高分子材料有以下几种：　　1. 聚乳酸与聚羟基乙酸及其共聚物　　 聚羟基乙酸、聚乳酸、以及二者单体的共聚产物聚丙交乙交酯，这些材料的突出优点是具有良好的生物性能及可以调控的物理和化学性能，可以通过水解而降解，其产物经人体新陈代谢排出体外。由于聚乳酸和聚羟基乙酸的代谢产物乳酸和羟基乙酸都是体内三羧酸循环的中间产物，吸收和代谢机理已明确并具有可靠的生物安全性，所以它们是迄今研究最为广泛，应用最多的组织工程支架材料。广泛应用于骨、软骨和皮肤等软硬组织的组织工程修复。　　 编者所合成的低分子量聚乳酸（凝胶状）与HA复合作为骨缺损修复材料，利用二者的优点解决了HA颗粒的赋形和操作问题，而且植入骨内后能促进骨形成，取得了较好的效果。还将高分子量聚乳酸（固体状）作为骨固定装置，待骨形成后不再去除。但还未确定多大分子量的聚乳酸在体内能与新骨形成同步。　　2. 胶原　　胶原(collagen) 是哺乳动物体内结缔组织的主要成分之一,构成人体30 %以上的蛋白质,结缔组织的强度和韧性主要依靠它来维持，具有极好的生物性能。I 型胶原的天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸(Asp-Gly-Glu-Ala) 多肽序列是一种特异性的细胞粘附区,能够促进成骨细胞粘附,可介导细胞外信号进入细胞,激活细胞内外的各种信号传递通路,影响细胞的分化与生长。胶原常用作人工皮肤、骨、人工肌腱、人工晶体和人工血管的组织工程支架材料。胶原作为组织工程支架材料因其强度有限，在实际工作中常用胶原与其它材料复合，以改善其力学强度。　　3. 海藻酸盐　　藻酸是从海洋生褐藻中提取的一种线性多糖,由D-甘露糖醛酸和L-古洛糖酸这两种糖醛酸以β-1 ,4 和α-1 ,4 糖苷键联结所形成的共聚体，藻酸盐是藻酸的盐类。以藻酸盐作为骨、软骨细胞载体，成功地获得了组织工程化骨和软骨。　　 藻酸盐凝胶作为组织工程的载体具有承载细胞量大、细胞的生存状态接近体内状态、有利于细胞分泌基质和保持基质浓度等优点。但是单独应用海藻酸盐作为载体进行骨组织工程的载体, 其机械强度不足且不利于血管长入和营养交换。另外，藻酸盐在体内由于淋巴细胞和炎症细胞的刺激和诱导通常会发生纤维化反应,可导致植入体内的细胞功能丧失。　　4. 壳聚糖　　 几丁质是一种广泛存在于昆虫、甲壳类动物外壳及真菌细胞壁中的天然多糖。几丁质经脱乙酰化反应变成壳聚糖。壳聚糖及其衍生物具有良好的生物性能和生物可降解性。壳聚糖在体内各种酶的作用下降解成N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖等低聚糖,且降解产物在体内不积累,因而无免疫原性。经改性后的壳聚糖可用于组织工程化骨、皮肤、粘膜等。目前国内外正从事在烧伤外科、药物载体、细胞包囊、人工角膜、人工晶体、人工血管等许多领域的研究和开发应用。　　5. 聚羟基丁酸酯　　聚羟基丁酸酯是微生物在不平衡生长条件下储存于细胞内的一种高分子聚合物, 广泛存在于自然界许多原核生物中。试验研究表明，PHB是较为理想的组织工程支架材料，所以被广泛用于骨、软骨组织、皮肤及粘膜修复的试验研究中。但是单纯用PHB作为支架材料也有其不足之处,如PHB的亲水性不好,对细胞的吸附能力不强,为此要对PHB支架材料进行表面修饰, 即用其它生物可降解材料对PHB多孔材料进行表面处理。PHB比其它材料(如PE)有更好的骨形成特性,有较高的早期新骨形成速率,同时植入材料在3个月内物理性能没有明显下降。　　6. 天然丝蛋白　　 天然丝是由鳞翅目幼虫（蚕）、蜘蛛、蝎子、螨等生成的蛋白聚合物。在过去二十年中，蚕丝的生物性能问题逐渐被发现，但是这一问题可能是由于蚕丝内的丝胶（胶样蛋白）所引起的。最近的研究表明核心丝纤维蛋白纤维较之其它常用生物材料如：聚乳酸和胶原，有同样好的生物性能。而且，丝纤维尚具有其它优势如：1.具有极佳的机械性能；2.其侧链具有高度可修饰性，使生长因子和黏附因子可以较为容易地接枝到丝纤维上；3.这一纤维蛋白家族还可以通过基因工程的方法改变结构，使其具备更好的应用、开发基础。这些特点使得丝蛋白成为未来骨和韧带组织工程修复的理想的支架材料。蚕丝和蜘蛛丝是现在是研究得最多的两类可生物降解天然丝材料。丝纤维蛋白可以被加工成泡沫状、膜状、纤维状和网状，可制作具有高机械性能的组织工程支架，用于修复强韧度较大的组织，如骨、韧带、肌腱、软骨和血管等。　　（三） 陶瓷材料　　 组织工程中采用的陶瓷材料作为细胞载体支架，直接与活细胞、机体组织和体液相接触，在复杂的体内外生物环境下，具有与机体组织良好的生物性能和长期稳定的化学性质，在与体液接触时能经受氧化、水解、腐蚀等作用，同时具备优良的力学性能。在组织工程中使用的陶瓷材料主要有生物活性陶瓷和生物降解陶瓷。　　 生物活性陶瓷是指能与活体骨组织、活体软组织形成化学键合的陶瓷材料。此类材料最主要的特点是在材料和组织界面发生生物反应，从而使组织和材料强有力的结合在一起，这种结合主要是由羟基磷灰石在界面处的沉积而实现的。界面结合强度随时间增长而增强，与骨折愈合的情形相似。典型的生物活性陶瓷主要包括两类：一类是生物活性玻璃和玻璃陶瓷，另一类是磷酸钙基生物陶瓷。生物活性陶瓷的良好的生物性能首先来源于此类材料含有通常生理环境中也含有的离子（Ca2+、K+、Mg2+、Na+等）。　　 可降解生物陶瓷是一种暂时性的替代材料，植入体内后会被逐渐吸收和降解，同时新生骨逐渐生长而替代之。最早应用的生物降解陶瓷为石膏，其生物性能虽好，但被吸收速率很快，与新生骨生长速率不能匹配。目前广泛应用的生物降解陶瓷是一系列磷酸钙基陶瓷，包括-磷酸三钙、-磷酸三钙、磷酸氧四钙等，其中-磷酸三钙陶瓷应用最广泛。可降解生物陶瓷在体内可被降解吸收，并随之为新生组织所替代，故被认为也是一种生物活性陶瓷，主要用于不承力部位的骨缺损修复和替换，如骨缺损腔充填、盖髓剂、牙槽嵴增高、耳听骨替换及药物释放载体等。　　（四） 复合材料　　 从材料科学角度看，骨可视为一种复合材料。骨的成分主要是有机的胶原和无机的羟基磷灰石。从这一认识出发，研究了数十种骨替换复合材料，研究内容逐步由高强、高模量纤维复合材料发展到生物活性陶瓷和聚合物复合材料。然而，达到临床应用水平的还很少，是正在发展的领域。现在受到关注较多的复合材料主要有以下几类。　　1. 生物活性陶瓷的复合增强　　 将生物活性羟基磷灰石颗粒掺入氧化物陶瓷，赋予高强度生物惰性氧化物陶瓷（例如氧化铝、氧化锆和氧化钛等）以生物活性，可获得高强度的生物活性复合陶瓷材料。热等静压烧结制备的羟基磷灰石氧化物复合陶瓷的力学性能与对应的氧化物陶瓷性能接近，但植入体内后与骨的结合强度有很大提高。　　2. 纤维增强复合材料　　 由于骨再建需要有适当的应力刺激，通常认为金属的高刚度和高弹性模量会导致植入体与骨之间的力学失配，从而使骨发育不良。为此，可以用聚合物复合材料技术来改进骨植入材料的弹性模量，形成良好的力学匹配以获得较为理想的骨的再建。使用长纤维、连续纤维和（交联）聚合物基体，可以在较大范围内改进复合体的力学性能。尽管如此，上述复合材料并未在临床得到实质性应用，主要原因是：现有的聚合物基体树脂的生物性能并不比金属好，甚至还更差（如大多数热固性树脂）；同时，对于在生理环境中聚合物基复合材料的可靠性寿命的认识远不如对金属基材料。在不确定的条件下，很难将聚合物基复合材料用于长干骨这一高负载部位。　　3. 钙磷增强高分子复合材料　　Bonfield首先提出用两种材料分别模拟天然骨中的羟基磷灰石和胶原，使复合物更接近天然骨的力学性能并与骨形成“化学键合”，由此发展出更为理想的长期力学稳定的仿骨材料，用于骨缺损的治疗。钙磷相增强聚合物基复合材料的生物活性有不同程度的提高，这证实了通过引入生物活性的无机相以实现仿骨复合的可行性。但是由于强极性的无机相成分与弱极性的聚合物间的亲和力很低，无机钙磷粉末颗粒间不能“固化”，另外又有高的团聚性，所以难以大幅度提高钙磷颗粒的均匀分散性，及其在复合物中的含量，聚合物的增强效果存在一定限度，强度还不能满足临床要求，只能用于非承力部位。　　4. 生长因子及其与支架材料的复合　　人们从骨基质提取物和骨细胞培养物中分离和表征出许多骨生长因子。包括类胰岛素生长因子Ⅰ和Ⅱ（IGF-Ⅰ，IGF-Ⅱ）、转化生长因子β1和β2（TGF-β1，TGF-β2）、酸性和碱性成纤维细胞生长因子（FGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、造血生长因子（HGF）以及骨形态发生蛋白（BMP）等。骨生长因子在局域骨形成中起着潜在的决定性作用。例如：BMP与不同性质的基底材料复合，显示出不同的异位成骨效果。BMP目前极少应用于临床，主要的问题是给药途径、剂型和生物活性的保持，常规的方法要使其在体内发挥作用需要以大大超过生理水平的剂量给药。所以，研制适宜的载体材料是BMP以及其它生长因子能否成功投入临床应用的关键。 二、牙组织工程　　在牙再生的研究中，我们面临的是一个由上皮组织和间质组织通过复杂的相互作用而形成的结构。在蕾状期及此前，牙源性上皮起诱导决定作用，将此时的牙源性上皮与非牙源性甚至非口腔间充质组织结合，仍然能产生正常发育的牙胚；到了蕾状期后这种诱导决定作用转移到了间充质一方（牙乳头），此时的牙乳头与非牙源性口腔上皮组织仍然能形成牙胚，即在牙乳头中存储和表达了所形成牙的形态、位置信息，一直到钟状晚期，这种诱导能力依然存在。牙胚的发育主要就由这种上皮-间充质相互作用调节。长期以来，人们便已知在牙髓中还存在着形似成纤维细胞的未分化间充质细胞，它在TGF-β、BMP等因子的诱导下会分化出造牙本质细胞，它可能是胚胎细胞的残余或是保留了胚胎源性的细胞，即牙干细胞。编者通过对牙干细胞的研究结果，提出采用细胞生物学的方法从成体牙髓组织中提取出这部分细胞，在体外培养扩增后将细胞接种在具有优良生物性能的可生物降解与吸收性材料支架上，再与同源或异源胚胎上皮组合，形成新的牙胚，再植入生物体内，最终得到与天然牙完全相同的组织工程牙的构想。　　（一） 牙齿发育的分子机制　　牙齿是发育生物学研究的一个经典模型，其发育过程中发生(initiation)，定位(pattern and Position)，成形(morphogenesis)的机理与过程具有很高的典型性。对牙齿的发育的研究帮助我们了解了很多发育的基本原理与机制。从60年代对牙胚组合实验的研究开始，在许多学者坚持不懈的努力下，我们对牙齿发育的了解已从形态学水平深入到了分子水平。尤其在最近5年内，研究者已对主导牙齿发育的上皮－间充质作用有了大体的了解，并将眼光集中在四个主要的信号分子家族上：BMP、FGF、Wnt和Shh。牙齿发育涉及了很多种类的基因，目前已有超过200个分子被研究。　　从目前的研究结果我们可以看到，从牙发育起始一直到最后牙尖形成都是由大致相同的机理反复作用调控的，尤其是FGF与BMP的相互作用。这些作用机制在牙发育的不同时期发挥了不同的作用。这种现象在其它器官的发育中也存在。它给我们的研究带来了一个问题，即基因敲除动物模型常在发育早期即停止而不能继续，使我们无法了解这些基因在后期的作用。如大多数基因敲除小鼠牙齿发育到蕾状期就停止，使我们难以了解对晚期牙尖形态调节起作用的机制。目前对牙齿发育的研究仍在继续深入中。研究方向集中在两个方向：一是继续研究已知的四个信号途径并试图寻找新的信号分子；二是研究信号是如何作用于组织细胞使其发生形态，粘附的改变。　　（二） 干细胞　　目前干细胞的研究可分为两大领域：胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell, ES)是由囊胚中的内细胞团（ICM）而来的，既具有多向分化、发育成多种细胞的能力，又可以保持不分化状态持续生长更新的一类干细胞体系。胚胎干细胞具有发育全能性，能在一定条件下分化出内胚层，中胚层和外胚层的组织。 干细胞起源　　成体干细胞是具有无限或很强的自我更新能力的细胞，其能分化产生至少一种高度分化的后代细胞。干细胞应具有两个基本性质：（1）自我更新能力，能通过分裂维持自身群体的稳定；（2）分化能力，在一定条件下其能分化产生具有特定功能的分化细胞。 　　牙干细胞研究是在口腔医学领域刚刚开始发展的一个热点问题。Gronthos等的研究了人牙髓干细胞的体外分化，免疫组织化学特征，可能含量。结果表明人牙髓干细胞在牙髓细胞中含量约在22-70/104左右，比骨髓间充质干细胞在骨髓基质细胞中的含量略高，20余种抗体检测未发现有特异性分布。从目前研究看，我们对干细胞仍知之甚少，而干细胞的巨大应用潜力使它注定在未来很长一段时间内继续作为热点存在，进一步的研究将集中在干细胞调控机制，应用基础等方面。　　（三） 牙组织工程的研究现状　　数十年来，人们一直试图通过生物工程学的方法修复牙齿。早期，一些学者曾经尝试在体内异位使牙组织生长，以及在体外培养牙蕾。近年来，牙组织再生工作的重心转移到在牙髓组织内寻找和鉴定假设的牙干细胞。这些研究说明，通过培养牙髓组织中特定的牙髓细胞，可以得到包含牙本质和牙髓的牙样组织。最近，C.S. Young等，将游离的猪第三磨牙牙蕾细胞接种到生物可降解支架上，然后将其植入鼠体内20-30周，形成了含有牙本质、成牙本质细胞、分化良好的牙髓腔以及可能的上皮根鞘、成牙骨质细胞和形态正常釉组织和已经形成的牙釉质，从而第一次通过解离的牙胚组织的培养得到了具有较完整结构的牙组织，同时说明了猪第三磨牙牙蕾组织内含有上皮和间质牙干细胞，证实了通过组织工程学的方法再生牙组织是可能的。 <tr

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